茵陈蒿汤调节胆汁酸代谢并干预阻塞性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA损伤的研究

刘军舰，李忠廉，尚海涛

阻塞性黄疸是临床常见病、多发病，多因胆结石、胆道闭塞、肿瘤压迫等胆管机械性梗阻导致胆汁淤积所致，可引起肝组织、胆管等全身系统的一系列病理变化［1］。胆汁排泄受阻引起胆汁酸在肝细胞内淤积，疏水性胆汁酸淤积可以通过炎症反应机制、线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径等损伤肝细胞［2］。如何有效地减少病理条件下疏水性胆汁酸对肝细胞的毒性作用是一个亟需解决的问题。中医治疗黄疸历史悠久，临床以茵陈蒿汤随证加减，已广泛用于肝胆系统疾病及药物所致的肝脏损害，特别是对各种热郁于里，湿无出路，湿热蕴结所致黄疸的治疗，显示出良好的疗效。但茵陈蒿汤对于阻塞性黄疸疾病的多靶点、多途径、多效应的作用机制尚未十分明确。笔者对阻塞性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA（mtDNA）的损伤情况进行了定量研究，旨在探讨其变化与胆汁酸代谢的相互关系，以及中药茵陈蒿汤对其调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 提取试剂：基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN生物公司）；实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒：Super Real Premix（SYBR Green）试剂盒（TIANGEN生物公司）。电泳仪（北京六一仪器厂）；电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；凝胶成像仪（培清科技JS-680B凝胶成像仪）；分光光度计：NANODROP 1000（Thermo 公司）；qPCR仪：ABI7500（ABI 公司）；生化分析仪：新锐全自动生化分析仪XR220PLUS（中山市新锐医疗设备科技有限公司）；小动物专用吸入麻醉机：VIP 3000（美国Matrx）。

1.2 实验动物及分组 成年SD大鼠54只，体质量200～230 g，雄性，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（实验动物使用许可证号：SCXK 京2014-0004；动物伦理委员会通过编号：NKYY-DWLL-2019-081），委托天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室动物中心饲养，饲养管理严格按照本中心制定的实验动物中心操作规程（SOP）进行。

1.3 中药方剂 依据《伤寒论》中茵陈蒿汤剂量组成折合：茵陈180 g，桅子150 g，大黄60 g，共计390 g［3］。中药购于天津市南开医院中药制剂室，先用冷水浸泡30 min，煎煮2次，第1次45 min，第2次30 min，取2次煎煮液浓缩至390 mL，每mL含生药量1 g。

1.4 动物分组、造模及给药方法 应用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、茵陈蒿汤组，每组18 只。造模方法为：术前12 h禁食水，2.5%维持浓度的异氟烷吸入麻醉后消毒，上腹正中切口入腹。以幽门部为标准，翻转引出十二指肠乳头部，再追踪胆总管，在肝门处分离出胆总管；模型组和茵陈蒿汤组于胆总管中上1/3 行双重结扎，手术24 h 后观察大鼠小便颜色变黄即说明胆道梗阻性黄疸模型建立成功。假手术组游离上段胆总管后关腹。大鼠自建模后第3天起茵陈蒿汤组每日给予茵陈蒿汤剂（相当于生药1 g/mL）3.6 mL/kg灌胃，假手术组和模型组每日给予等量生理盐水灌胃。观察时点为梗阻建模后第1、3、8天。

1.5 标本留取及检测指标 每时点各组处死大鼠6只，留取肝组织以备qPCR检测。建模后第8天用代谢笼留取6 h尿，记录尿量变化情况，留取血液标本，检测血总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、丙氨酸转氨酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、血清总胆汁酸（TSBA），尿总胆汁酸（TUBA）。

1.6 大鼠肝组织mtDNA 相对量检测 取大鼠肝组织1 g，将其剪成细小碎粒状，放入Eppendorf管中，应用碱裂解法裂解组织细胞，离心后取上清液，应用氯仿异戊醇直接提取mtDNA。因ND1 基因片段为mtDNA 高保守序列，故其可以反映DNA 模板中mtDNA 的总量，以β-actin 基因作为管家基因。运用Premier 5.0 和Oligo 6 软件进行引物设计。ND1 引物序列 ：上 游 5´-GGCTACATACAATTACGCAAG-3´，下 游 5´-TAGAATGGAGTAGACCGAAAGG-3´，产物大小 267 bp；βactin 引物序列：上游 5´-ATCCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3´，下 游 5´-GGCTACAACTACAGGGCTGACCAC-3´，产物大小177 bp。PCR 体系为SYBR GreenⅠ体系，DNA 模板2 μL（约100 μg），上下游引物各0.4 μL（终浓度0.2 μmol/L），H2O 7.2 μL，总反应体积10 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 20 s，退火 55 ℃，20 s，延伸 72 ℃ 30 s，32 个循环。反应结束后，根据梯度稀释的PCR 产物绘制标准曲线，应用Sequence Detector System Version 1.3.1 软件（Applied Biosystems）进行数据处理。目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt。

1.7 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 26.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、GGT 水平比较 与假手术组比较，模型组TBIL、DBIL、ALT、GGT升高；与模型组比较，茵陈蒿汤组TBIL、DBIL、ALT、GGT均有所改善，见表1。

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

Tab.1 The serum contents of TBIL,DBIL,ALT and GGT in three groups of rats表1 3组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和GGT含量（n=6，）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05；表2同

组别假手术组模型组茵陈蒿汤组F TBIL（μmol/L）1.55±0.12 174.04±27.23a 135.67±16.79ab 150.288＊＊DBIL（μmol/L）0.65±0.14 141.30±12.77a 110.50±10.96ab 344.534＊＊ALT（U/L）63.53±11.41 422.26±56.78a 284.15±39.84ab 126.096＊＊GGT（U/L）1.02±0.06 42.30±6.75a 27.05±3.89ab 123.930＊＊

2.2 3 组大鼠血、尿中TBA 与尿量的比较 与假手术组比较，模型组血、尿TBA均升高，尿量下降；与模型组比较，茵陈蒿汤组血TBA 下降，而尿TBA 及尿量升高，见表2。

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3组大鼠血、尿中TBA、尿量比较 （n=6，）

Tab.2 The serum and urine contents of TBA and urine volumes in three groups of rats表2 3组大鼠血、尿中TBA、尿量比较 （n=6，）

组别假手术组模型组茵陈蒿汤组F血TBA（μmol/L）21.43±2.01 334.04±41.08a 223.66±31.55ab 160.289＊＊尿TBA（μmol/L）1.21±0.32 281.56±43.00a 389.59±65.79ab 118.626＊＊尿量（mL）8.92±0.93 3.49±1.45a 6.01±1.77ab 22.759＊＊

2.3 3 组大鼠肝细胞mtDNA 相对表达量比较 与假手术组比较，模型组与茵陈蒿汤组mtDNA相对表达量于各时间点均减少；模型组mtDNA相对表达量进行性减少；茵陈蒿汤组mtDNA 的相对表达量第8天较第3天回升，见表3。

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3组大鼠mtDNA相对表达量 （n=6，）

Tab.3 The relative quantity of mtDNA in three groups表3 3组大鼠mtDNA相对表达量 （n=6，）

＊＊P＜0.01；A 与前一时间点比较，P＜0.05；a 与假手术组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05

组别假手术组模型组茵陈蒿汤组F第1天1.03±0.12 0.68±0.10a 0.64±0.09a 23.388＊＊第3天1.08±0.11 0.39±0.08Aa 0.35±0.07Aa 135.362＊＊第8天1.09±0.16 0.27±0.06Aa 0.73±0.11Aab 75.959＊＊F 0.439 41.922＊＊27.408＊＊

3 讨论

中医理论认为黄疸形成的关键是湿、热二邪，病位上，黄疸的病位主要在脾胃肝胆，黄疸病证基本病机是湿热瘀浊阻滞，胆液不循常道外溢而发黄。针对湿热内阻致黄的病机，张仲景提出“诸病黄家，但利其小便”的治疗原则。清热利湿之茵陈蒿汤为退黄代表方剂之一，其服用方法中提到“分温三服，小便当利，尿如皂角汁状，色正赤。一宿腹减，黄从小便去也”。笔者认为茵陈蒿治疗黄疸治法上运用“利其小便”之法，起到疏肝利胆、清热利湿的功效，使“黄从小便去”。本研究显示，胆道阻塞发生后，模型组TBIL、DBIL、ALT、GGT 升高，茵陈蒿汤组大鼠的上述指标较模型组均改善，提示茵陈蒿汤对阻塞性黄疸大鼠肝功能及黄疸指标有改善作用。

阻塞性黄疸发生后，疏水性胆汁酸淤积在肝损害中扮演重要角色，是导致肝细胞损伤、凋亡或坏死的主要因素之一［4］。正常情况下，仅有少量胆汁酸可从肝细胞中逃逸，经循环系统由肾过滤到尿液中［5］。阻塞性黄疸发生时，正常的胆汁肝-肠循环遭到阻断，此时肾脏对胆汁酸的“替代性途径”排泄作用尤为重要［6］。本研究显示，模型组大鼠血TBA 升高，同时尿TBA含量也升高，提示肾脏的排泄可能成为此时胆汁酸的主要消除途径，这与Krones 等［7］的研究结果一致。茵陈蒿汤复方中含有与胆汁酸代谢有关的多种活性成分，如β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚以及异鼠李素等［8］。Cai 等［9］认为这些生物活性成分可以调节胆汁酸的合成及代谢途径。本研究发现，与模型组相比，给予茵陈蒿汤治疗的大鼠，循环血胆汁酸含量下降，尿量及尿胆汁酸含量均增加。因此笔者认为，茵陈蒿汤可以通过替代性途径来增强胆汁酸的排泄，增加胆汁酸的尿液排泄，降低循环血总胆汁酸。但本研究并未检测茵陈蒿汤调节胆汁酸代谢的调控因子表达情况，相关通路具体作用机制有待进一步研究证实。

线粒体是阻塞性黄疸时肝细胞内最先受损害的细胞器，而线粒体功能是决定肝细胞功能的重要因素［10］。Arab等［2］认为疏水性胆汁酸在肝细胞内淤积对线粒体结构和功能有明显损害作用。ND1DNA定位于mtDNA（碱基序列3307～4263），相对保守的特点使研究者可以通过检测ND1 DNA 量的变化来反映mtDNA的变化情况。本研究显示，模型组肝组织mtDNA的量随胆道阻塞时间延长而进行性减少，茵陈蒿汤组在给与茵陈蒿汤治疗后mtDNA 的量逐渐回升，提示茵陈蒿汤对阻塞性黄疸大鼠肝细胞mtDNA起保护作用。

综上所述，笔者认为茵陈蒿汤可以通过替代性途径来增强胆汁酸的排泄，增加胆汁酸的尿液排泄，降低循环血总胆汁酸，茵陈蒿汤可能通过肝-肾轴途径调节胆汁酸代谢以减少肝细胞mtDNA损伤，进而改善阻塞性黄疸大鼠肝功能。