桑叶生物碱对肝纤维化小鼠抗氧化能力及炎症因子水平的影响

王祖文，沈以红，黄先智，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆 400716；2.西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716）

肝纤维化是世界范围内的常见疾病，主要由各种慢性肝损伤引起，包括病毒、酒精、药物诱导、胆汁淤积和代谢性疾病[1]，其主要特征是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积[2]。在肝纤维化的发生发展中，氧化应激发挥了重要作用，且与其他因素（如炎症、细胞凋亡、自噬）相互影响、共同参与[3]。在肝纤维化病理生理过程中，采取一定手段来降低氧化应激及炎症水平对机体的影响对阻碍肝纤维化发展进程具有重要意义。目前，除了采用药物防治肝纤维化，许多研究者也把目光转向一些天然活性物质，如多糖、黄酮、生物碱类化合物。据报道百花花青素[4]、老鼠簕生物碱[5]、金蝉花多糖[6]等活性物质可通过抵抗机体氧化应激、降低炎症反应，来抑制HSC的激活和ECM沉积，从而逆转实验动物肝纤维化。

桑叶生物碱是桑叶的特征活性成分，是糖环上的氧原子被氮原子取代的一系列多羟基生物碱，具有降糖降脂[7-8]、抑制病毒活性[9]、减轻肾损伤[10]、改善小鼠氧化损伤[11]等作用。本实验室前期研究发现桑叶生物碱可显著降低肝纤维化小鼠血浆谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，减轻小鼠肝纤维病变程度[12]。鉴于目前鲜见桑叶生物碱在减轻氧化应激以及炎症反应来改善肝纤维化方面的相关报道，因此本研究从这两点入手，探讨桑叶生物碱对肝纤维化小鼠机体抗氧化能力和炎症因子的影响，旨在为进一步研究桑叶功能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性昆明种小鼠60 只（4 周龄），体质量（20±2）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003；基础饲料购于重庆医科大学实验动物中心；高脂饲料为重庆市农产品加工及贮藏重点实验室自制，含基础饲料69.5%（质量分数，下同）、猪油12%、蔗糖10%、蛋黄粉4%、胆固醇4%、胆酸钠0.5%。

桑叶粉末由重庆畜牧科学院蚕研所提供；桑叶生物碱（总生物碱质量分数93.57%）为重庆市农产品加工及贮藏重点实验室自制[13]。

橄榄油、四氯化碳（CCl4） 成都市科龙化工试剂厂；水飞蓟宾（纯度98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；Masson三色染色试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒 南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6、环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2酶联免疫吸附检测试剂盒上海优选生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

EG1105H型石蜡切片机 德国Leica公司；包埋盒江苏世泰实验器材有限公司；Synergy H1型酶标仪美国基因有限公司；DHP-9082型恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；生物显微镜 日本Olympus株式会社；ALPAAI-4LSC型高速离心机 德国Christ公司；DW-HL438型超低温冰箱 合肥美菱股份有限公司；5880R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理

本研究获得西南大学实验动物保护协会许可，小鼠按照西南大学实验动物保护和使用规则饲养，室温22～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），自由进食饮水。60 只昆明种小鼠适应性喂养7 d后，随机分成正常对照组（10 只）、造模组（50 只）。造模组腹腔注射体积分数10% CCl4橄榄油溶液（5 mL/kgmb），隔天注射1 次，持续8 周，并在此期间给予高脂饲料喂养；正常对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油溶液，并给予基础饲料喂养。造模成功判定：正常对照组和造模组小鼠之间，血浆谷草转氨酶、谷丙转氨酶活力、肝纤维4 项指标（透明质酸、层黏连蛋白、III型前胶原、IV型胶原）水平差异显著（P＜0.05），且肝纤维化小鼠肝脏组织病变明显，胶原沉积。

将造模成功的50 只小鼠，随机分成模型组、阳性药物组和桑叶生物碱低、中、高剂量组，每组10 只。桑叶生物碱低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kgmb的桑叶生物碱溶液，阳性药物组灌胃100 mg/kgmb水飞蓟宾水溶液，正常对照组和模型组给予等量蒸馏水（10 mL/kgmb），每日1 次，连续灌胃45 d，同时喂饲基础饲料。

1.3.2 实验样品收集

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素钠的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存备用。采血完毕后，颈椎脱臼处死小鼠，快速取出肝脏，用冷生理盐水漂洗除去表面血液，取肝左叶置于体积分数4%多聚甲醛溶液固定48 h，脱水，石蜡包埋，切片（厚度约为4 μm），进行Masson染色，在光学显微镜下（200×）进行肝组织病理学观察，拍照。

1.3.3 指标测定

称取0.3 g肝组织，加入9 倍体积的生理盐水，于冰浴条件匀浆后，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min取上清液待测。按照相应的试剂盒说明书标示的步骤测定肝组织TC、TG、HYP（碱水解法）以及血浆MDA、GSH、SOD、T-AOC水平；血浆IL-6、TNF-α及肝组织COX-2水平的测定按照酶联免疫吸附检测试剂盒说明书标示的步骤进行。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。实验结果均以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析比较数据显著性差异，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠肝组织TC、TG、HYP含量的影响

CCl4产生的CCl3·自由基及一系列的活性氧与生物大分子共价结合将导致合成障碍，造成脂质代谢紊乱，促使TC、TG在肝组织中大量积累[14-15]，在CCl4和高脂饮食两种因素的联合作用下会加快肝损伤向肝纤维化的形成[16]。ECM沉积是肝纤维化形成的主要特征之一，表现为胶原蛋白含量显著增多。HYP是胶原蛋白所特有的氨基酸，其含量可反映细胞合成分泌胶原蛋白的水平，与肝纤维化程度呈正相关，是评估胶原蛋白含量和肝纤维化程度的常用指标[17]。

表 1 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠肝组织TC、TG、HYP含量的影响（n＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TC, TG and HYP in hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表1可知，正常对照组小鼠TC、TG、HYP处于较低水平。与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织TC、TG、HYP含量显著上升（P＜0.05），说明CCl4联合高脂饮食诱导的小鼠肝脏不仅有大量脂质积累、胶原蛋白增多，还出现了明显的纤维化。与模型组比，阳性药物组小鼠TC、TG、HYP含量分别显著下降53.85%、44.44%、29.60%（P＜0.05）；桑叶生物碱各剂量组小鼠肝组织TC、TG、HYP含量呈现明显的下降趋势，其中桑叶生物碱高剂量组TC、TG、HYP分别显著降低53.85%、41.67%、28.81%（P＜0.05），与阳性药物组间无显著差异（P＞0.05），但未恢复至正常水平。以上结果表明，桑叶生物碱能有效降低肝纤维化小鼠TC、TG、HYP水平，减少ECM沉积，减轻肝纤维化程度。

2.2 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆抗氧化相关指标的影响

在肝脏受到氧自由基的攻击时，机体抗氧化防御系统平衡被打破，导致机体发生氧化应激。MDA是机体发生脂质过氧化反应的主要代谢产物，过量时会严重破坏细胞膜结构，也是公认的肝内自由基产生的一个间接指标[18]。内源酶和非酶抗氧化剂共同构成机体的一个复杂的抗氧化防御系统，这些物质共同作用以抵抗自由基对重要生物分子如蛋白质、DNA、脂质乃至机体组织的破坏[19]。GSH是一种重要的细胞无酶抗氧化剂，主要在肝脏中合成，广泛分布于各种器官内，是自由基的清除剂[20]。SOD是细胞中强大的酶抗氧化剂，与GSH共同作用清除肝内的超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤；SOD水平可间接反映机体清除内氧自由基的能力[21]。仅通过机体GSH、SOD水平来评价机体抗氧化能力是不全面的，因此采用T-AOC共同反映机体的总抗氧化能力[22]。

表 2 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆中抗氧化相关指标的影响（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on antioxidant defense indictors in plasma of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表2可知，正常对照组小鼠血浆中GSH浓度、SOD活力、T-AOC处于较高水平，MDA浓度处于较低水平。与正常对照组比，模型组小鼠MDA浓度显著升高了130.67%（P＜0.05）；而GSH浓度、SOD活力、T-AOC分别显著下降了81.10%、45.14%、57.89%（P＜0.05），说明小鼠肝脏受到自由基攻击，机体抗氧化系统遭到破坏，清除自由基能力减弱。与模型组比，桑叶生物碱各剂量组的MDA浓度均有所降低，GSH浓度、SOD活力、T-AOC均有所上升；其中，桑叶生物碱高剂量组较模型组小鼠血浆的MDA浓度显著下降了33.60%（P＜0.05），GSH浓度、SOD活力、T-AOC分别显著升高了136.83%、45.14%、78.13%（P＜0.05）。高剂量桑叶生物碱对MDA、GSH的作用与该实验剂量的水飞蓟宾效果相当（P＞0.05），对SOD和T-AOC的作用效果不如水飞蓟宾，二者差异显著（P＜0.05）；但无论是该实验剂量下的桑叶生物碱还是水飞蓟宾，均未使上述指标恢复至正常水平。以上结果表明，桑叶生物碱能在一定程度上恢复肝纤维化小鼠的抗氧化能力，减少体内自由基的产生，降低氧化应激水平。

2.3 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠炎症因子的影响

氧化应激和炎症紧密联系，一方面，氧化应激能促进TNF-α、IL-6等炎症介质的表达；另一方面炎症细胞活化后产生更多的活性氧，导致炎症性病变后的氧化应激水平升高[3]。有研究报道称在肝纤维化动物模型中，血清炎症因子TNF-α和IL-6水平随着纤维化程度的加重而升高，呈正相关关系[24]。COX-2参与细胞生长发育、凋亡、恶性转化、炎症反应等多种病理过程[24]。有研究认为COX-2是炎症反应的标志[25]，它介导的炎症反应在肝纤维化形成过程中起关键作用，当机体出现炎症反应导致肝脏受损，COX-2表达会明显升高，进而加剧肝损伤[26]。

由表3可知，正常对照组小鼠TNF-α、IL-6质量浓度和COX-2活力处于较低水平。与正常对照组比，模型组小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分别显著升高了18.80%、19.92%、28.26%（P＜0.05），说明肝纤维化小鼠机体出现炎症反应，肝损伤加剧。与模型组比，桑叶生物碱各剂量组小鼠上述指标均有所下降；其中，桑叶生物碱高剂量组小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分别显著下降了9.96%、11.06%、10.02%（P＜0.05），与该实验剂量的水飞蓟宾效果相当（P＞0.05），但均未恢复至正常水平。结果表明，桑叶生物碱在一定程度上降低肝纤维化小鼠机体炎症水平。

表 3 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平的影响（n＝10）Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TNF-α,IL-6 and COX-2 in mice with hepatic fibrosis (n= 10)

2.4 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠肝组织病理学的影响

图 1 肝纤维化小鼠肝组织病理切片观察结果（200×）Fig. 1 Histopathological observation of hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (200 ×)

肝组织经Masson染色后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。由图1可知，正常对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞索排列分布整齐，仅肝小叶内中央静脉管壁周围有少量蓝色胶原纤维（图中黑色箭头所指）。模型组肝小叶结构遭严重破坏，可见广泛致密蓝色胶原沉积，肝脏汇管区和中央静脉周围纤维组织增生明显，且纤维组织向肝小叶内延伸形成纤维间隔。与模型组比较，阳性药物组和各剂量桑叶生物碱组的小鼠肝细胞索排列较为整齐，组织病变及纤维化均有不同程度的改善，以阳性药物组和桑叶生物碱中、高剂量组改善效果更为明显，但未恢复至正常水平。组织病理观察结果与上述指标测定结果一致，说明一定剂量的桑叶生物碱对肝纤维小鼠具有改善作用。

3 讨 论

CCl4是使用最广泛的诱导实验动物出现肝纤维化的化学性肝脏毒物[27]，在与高脂饮食的联合作用下，可加快实验动物肝纤维化的形成[28]。其中，CCl4经微粒体细胞色素氧化酶P450激活产生自由基CCl3·及Cl·，与肝细胞内大分子发生共价结合，引发氧自由基的生成[29-31]。本研究显示，CCl4联合高脂饮食作用导致肝纤维小鼠体内氧化应激水平升高，机体抗氧化能力下降，炎症水平升高。氧化应激在肝损伤中扮演着重要角色，氧化应激的诱导和机体抗氧化系统的失衡是肝纤维发病机制中常见情况[32]。有研究表明，桑叶生物碱能改善D-半乳糖诱导的小鼠机体氧化应激，减轻脂质等生物大分子的氧化损伤[11]。本实验结果显示，桑叶生物碱能降低肝纤维化小鼠MDA含量，提高SOD、GSH、T-AOC的水平，猜测桑叶生物碱能通过降低机体的氧化应激水平，提高抗氧化能力，来改善肝纤维化。在肝纤维化期间，炎症和氧化应激共同促进肝纤维的形成。一些研究报道称天然活性提取物可通过调节炎症因子水平来减轻CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织炎症坏死和肝纤维病变程度。如马冬梅等[33]报道田基黄提取物可通过调节IL-6、TNF-α及IL-1β水平来减轻肝纤维化小鼠症状；Chiu等[34]的研究也得到类似结果。本实验结果显示，在灌胃桑叶生物碱后，肝纤维化小鼠机体IL-6、TNF-α、COX-2炎症因子水平降低，胶原蛋白含量减少，病理切片同样观察到肝组织胶原纤维含量减少，推测桑叶生物碱可通过调节炎症因子水平从而改善肝纤维化。

综上所述，桑叶生物碱可改善小鼠肝纤维化程度，其机制可能与抗氧化、抗炎有关。HSC的激活与ECM沉积是肝纤维化典型特征，氧化应激和炎症能直接激活HSC，而活化的HSC可反过来激活氧化应激和炎症，促进肝纤维化的发生[3,33]，因此降低小鼠机体氧化应激和炎症水平对改善肝纤维化有重要意义。本实验仅是对该方面做了初步探讨，具体机制尚不明确，桑叶生物碱能否通过调节氧化应激介导肝纤维化中涉及的相关细胞因子如核转录因子κB、转化生长因子-β/Smads及下游通路来调控HSC表达、改善肝纤维症状，还需要进一步深入研究。