‘雪花’梨酒综合品质评价体系的建立

李丽梅，冯云霄，何近刚，钱 训，张少军，关军锋,*

（1.河北省农林科学院农产品质量安全研究中心，河北 石家庄 050051；2.河北省农林科学院遗传生理研究所，河北 石家庄 050051）

梨酒以梨为原料，经酵母发酵而成。酵母是酿造果酒的关键因素之一，其发酵特性直接影响着果酒的品质[1-3]。当前我国果酒生产所用酵母大多为葡萄酒发酵专用酵母，主要针对葡萄酒酿造所选育[4-6]。梨酒发酵酵母的筛选[7-8]尚处于实验室研究阶段，没有实现工业化生产。关于葡萄酒酿酒酵母对梨酒品质和抗氧化性能的影响目前报道较少，李丽梅等[9-11]研究确定了不同酵母发酵的不同品种梨、不同部位梨酿制梨酒中具有抗氧化功效的酚类物质，但未涉及其他成分测定；赵国群等[12]采用主成分分析法确定了影响梨酒品质的主要理化指标，但未涉及梨酒抗氧化性能评价。本实验研究了不同酵母对发酵梨酒中还原糖、总酸、多酚、总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和铁还原力的影响，并通过对相关指标进行因子分析，建立了梨酒综合品质评价体系，并采用逐步回归分析建立了评价梨酒综合品质的理论模型，期望通过此模型，简化梨酒的评价指标，同时为筛选适宜的酿酒酵母提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与试剂

新鲜‘雪花’梨于成熟期采摘于河北省赵县范庄‘雪花’梨种植基地。

酿酒酵母LA-BA、F33、2323、LA-PE、LA-RA、X16、LA-MA、EC1118、KD、F15、BO213、LA-DE、R-HST、LA-EC、RC212 法国LAFFORT公司。

酒石酸钾钠 天津博迪化工股份有限公司；碳酸钠、没食子酸、无水葡萄糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸铜、铁氰化钾、硫酸亚铁 天津市永大化学试剂有限公司；氢氧化钠 天津市大陆化学试剂厂；亚铁氰化钾 天津市北辰骅跃化学试剂有限公司；乙醇（色谱纯）、4-甲基-2-戊醇（色谱纯）天津市康科德科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂北京酷来搏科技有限公司；硝酸铝 山东西亚化学工业有限公司；芦丁、水杨酸 上海BBI生命科学有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源叶生物科技有限公司；过氧化氢、三氯乙酸、亚硝酸钠、亚甲基蓝天津市大茂化学试剂厂；三氯化铁 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪、UV-2600紫外-可见分光光度计日本岛津公司；ST 3100 pH计 美国奥豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 梨的前处理

‘雪花’梨采收后立即切分，去除果心后榨取果汁。加入蔗糖调整果汁糖度至22 °Brix，然后接种不同的市售商品化酵母，进行乙醇发酵，待糖度不再下降时结束发酵，经倒罐、静置、自然澄清，得到不同的‘雪花’梨发酵酒。对成品酒进行各指标测定。

1.3.2 还原糖、总酸质量浓度、pH值的测定与糖酸比的计算

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]，分别采用直接滴定法和电位滴定法测定梨酒的还原糖、总酸质量浓度。以还原糖含量/总酸含量计算得出糖酸比。采用ST 3100 pH计测定梨酒pH值。

1.3.3 总酚质量浓度的测定

参照鞠志国[14]的改进Folin-Ciocalteu法测定梨酒总酚质量浓度，以没食子酸为标准物质，建立标准曲线，于765 nm波长处测定OD值，计算总酚质量浓度。

1.3.4 总黄酮质量浓度的测定

参照赵玉平等[15]的方法测定梨酒总黄酮质量浓度，以芦丁为标准物质，建立标准曲线，于510 nm波长处测定OD值，计算总黄酮的质量浓度。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

参考Takako等[16]的方法测定梨酒DPPH自由基清除率，按下式计算。

式中：A0为DPPH-甲醇溶液的吸光度；Ai为样品溶液的吸光度。

1.3.6 羟自由基清除能力的测定

参照马晓华等[17]的方法测定并计算梨酒羟自由基清除率。以不同浓度VC为对照，计算羟自由基清除率，得出标准曲线。利用羟自由基清除率，根据标准曲线得出每毫升梨酒相当VC的质量，以表征羟自由基清除能力（单位mg/mL）。

1.3.7 还原力的测定

采用铁氰化钾法[18]测定梨酒还原力。

1.3.8 乙醇体积分数的测定

参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》[19]，采用气相色谱法测定梨酒中乙醇体积分数。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS统计分析软件对数据进行Duncan法样本间差异显著性分析、Pearson相关性分析，同时进行因子分析、逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同酵母酿制梨酒的品质

表 1 不同酵母酿制梨酒的还原糖、总酸、糖酸比和pH值比较Table 1 Comparison of reducing sugar, total acid, sugar/acid ratio and pH among pear wines fermented with different yeasts

如表1所示，不同梨酒的还原糖质量浓度差异较大，变异系数为33.9%。其中LA-BA梨酒的还原糖质量浓度最高，为2.95 g/L，LA-RA梨酒最低，为0.97 g/L。供试梨酒的还原糖质量浓度均低于4 g/L，说明本研究所选用酵母对梨的适应性较好，能够比较完全地将糖分转化为乙醇。不同梨酒的总酸质量浓度变异系数为26.1%，其中LA-BA梨酒的总酸含量最高，为7.43 g/L，LA-MA梨酒最低，为2.81 g/L。不同梨酒糖酸比的变异系数为18.9%，糖酸比最高的梨酒由F33酵母酿制，最低的由BO213酵母酿制。LA-BA梨酒相对于其他梨酒含有更多的糖和酸，但两者比较平衡，糖酸比适中。除LA-BA梨酒的pH值最低（3.82）外，其余梨酒的pH值均大于4，其中RC212梨酒的pH值最高，为4.35。不同梨酒pH值差异很小，变异系数仅为3.1%。说明酵母虽然对梨酒的pH值有一定影响，但产生的差异较小。

2.2 不同酵母对梨酒乙醇含量的影响

如表2 所示， 不同梨酒的乙醇体积分数在12.36%～13.26%，变异系数仅为2.0%，KD梨酒的乙醇体积分数最高，为13.26%，LA-BA梨酒的乙醇体积分数最低，为12.36%，两者的乙醇体积分数相差0.9%。本研究中梨酒的乙醇体积分数和市售葡萄酒相当，说明所选用酵母尽管是葡萄酒的酿酒酵母，但对梨的适应性好，发酵产酒能力均较强，适于酿制梨酒。

表 2 不同酵母酿制梨酒的乙醇含量Table 2 Alcohol contents in pear wines fermented with different yeasts

2.3 不同酵母酿制梨酒的抗氧化特性

表 3 不同酵母酿制梨酒的抗氧化能力比较Table 3 Comparison of antioxidant capacity among pear wines fermented with different yeasts

如表3所示，不同酵母酿制梨酒的多酚和总黄酮质量浓度不同，变异系数分别为10.3%和32.4%。其中LA-BA梨酒的多酚和总黄酮质量浓度均最高，分别为211 µg/mL和208 µg/mL，LA-EC梨酒的多酚质量浓度最低，为155 µg/mL；RC212梨酒的黄酮质量浓度最低，为67 µg/mL。不同梨酒的羟自由基清除能力差异较大，变异系数为47.5 %。F33梨酒的羟自由基清除能力最强，为0.899 mg/mL，LA-MA梨酒的羟自由基清除能力最弱，为0.196 mg/mL。不同梨酒的DPPH自由基清除率和铁还原力的变异系数分别为23.0%和17.4%，其中LA-BA梨酒表现突出，DPPH自由基清除率和铁还原力均最强，而RC212梨酒则表现最差，两者均最弱。说明LA-BA梨酒在抗氧化性能方面表现突出，而RC212梨酒则较差。

2.4 相关性分析结果

为了研究各变量间的关系，对梨酒的多酚质量浓度、总黄酮质量浓度、羟自由基清除能力、pH值、铁还原力、还原糖质量浓度、总酸质量浓度、糖酸比和DPPH自由基清除率这9 个变量进行相关性分析。

表 4 不同变量的相关性分析Table 4 Correlation analysis among different variables

如表4 所示，多酚质量浓度与黄酮质量浓度、铁还原力、D P P H 自由基清除率呈极显著正相关（P＜0.01）；黄酮质量浓度与铁还原力、还原糖质量浓度、总酸质量浓度、DPPH自由基清除率呈极显著正相关（P＜0.01），与羟自由基清除能力、pH值呈显著负相关（P＜0.05）；铁还原力与还原糖质量浓度、总酸质量浓度、DPPH自由基清除率呈极显著正相关（P＜0.01）；还原糖质量浓度与总酸质量浓度呈极显著正相关（P＜0.01），与糖酸比、DPPH自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05）；总酸质量浓度与DPPH自由基清除率呈极显著正相关（P＜0.01）；pH值与总酸质量浓度呈极显著负相关（P＜0.01），与铁还原力、还原糖质量浓度、DPPH自由基清除率呈显著负相关（P＜0.05）。

2.5 对不同酵母酿制梨酒的因子分析结果

由于不同梨酒的乙醇体积分数变异系数小，提取系数较小，因此在做因子分析时剔除了乙醇体积分数这个变量。经因子分析，提取各个因子的公因子方差，可知提取系数均大于0.7，其中对多酚的提取系数最低，为0.749，对糖酸比的提取系数最高，为0.975（表5）。

表 5 公因子方差Table 5 Common factor variance

通过因子分析，共提取了3 个特征值大于1.0的公因子，累积方差贡献率达到89.939%（表6），说明这3 个公因子能够很好地解释所有变量。

通过正交旋转法得到旋转成分矩阵（表6）。各因子选取载荷值绝对值大于0.700的指标作为解释变量。F1的方差贡献率为38.970%，解释变量包括pH值、还原糖质量浓度、总酸质量浓度，反映了梨酒的营养成分，命名为营养因子；F2的方差贡献率为33.975%，解释变量包括多酚质量浓度、黄酮质量浓度、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除率，反映了梨酒的抗氧化能力，命名为功能因子；F3的方差贡献率为16.993%，解释变量为糖酸比，反映了梨酒的风味，命名为风味因子。公因子方差贡献率是其权重，体现了各因子在评价中的作用大小，可见营养因子和功能因子的作用接近，风味因子的作用较小。

表 6 3 个公因子的初始特征值、方差贡献率、累计方差贡献率、及各变量在不同因子中的载荷值Table 6 Initial eigenvalues, variance contribution rates, accumulative variance contribution rates and loading matrix of three common factors

2.6 不同梨酒的综合因子得分及其品质评价结果

以多酚质量浓度、总黄酮质量浓度、还原糖质量浓度、总酸质量浓度、糖酸比、DPPH自由基清除率、铁还原力、羟自由基清除能力、pH值为变量，通过SPSS分析软件的因子分析法可直接得出各因子的得分值FAC1、FAC2和FAC3，依据各个因子得分值与综合因子得分的回归模型公式，采用公式F＝38.970%×FAC1+33.975%×FAC2+16.993%×FAC3计算不同梨酒的综合因子得分（F）。如表7所示，根据综合因子得分，各酵母酿造梨酒排序依次为：LA-BA＞F33＞2323＞LA-PE＞LA-RA＞X16＞LA-MA＞EC1118＞KD＞F15、BO213＞LA-DE＞R-HST＞LA-EC＞RC212。可知LA-BA所酿梨酒的综合品质最好，RC212梨酒较差，其他梨酒的综合品质则介于两者之间。

对梨酒的综合因子得分和各变量之间做相关性分析表明，梨酒的综合因子得分与多酚质量浓度、总黄酮质量浓度、铁还原力、还原糖质量浓度、总酸质量浓度和DPPH自由基清除率均呈极显著正相关（P＜0.01），与pH值呈极显著负相关（P＜0.01）（表8），说明营养成分含量越高，抗氧化能力越强，pH值越低，梨酒的综合得分越高。

表 7 不同酵母酿制梨酒的综合因子得分Table 7 Comprehensive scores of pear wine fermented with different yeasts

表 8 综合因子得分与各变量的相关性Table 8 Correlation analysis between comprehensive scores and variables

2.7 梨酒综合品质评价预测模型的建立

表 9 逐步回归法的结果Table 9 Results of stepwise regression method

以因子分析得到的不同梨酒综合因子得分为因变量，剔除独立性较差的变量糖酸比和pH值，以多酚质量浓度、总黄酮质量浓度、还原糖质量浓度、总酸质量浓度、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除率和铁还原力为自变量，进行逐步回归分析，建立梨酒综合品质评价理论模型（表9），得到的回归模型为：F’＝-3.123+0.486×+0.980×+0.006×+0.034×，其中和F’4分别代表还原糖质量浓度、铁还原力能力、多酚质量浓度和DPPH自由基清除率。模型的调整R2为0.996，接近1，说明估计的模型对观测值的拟合程度很高。方差分析结果表明F对应的P＜0.05，因此认为回归方程有效。将不同梨酒的对应变量值代入模型，得到每种梨酒综合品质的理论评分（表10），并将该评分与利用因子分析得到的综合因子得分进行相关性分析，r＝0.946（P＜0.01），说明该模型与实际评估结果相一致，具有很高的可靠性。基于此模型，未来可以对梨酒的还原糖质量浓度、铁还原力、多酚质量浓度和DPPH自由基清除率4 个指标进行测定，然后计算得分，对梨酒品质进行综合评价。基于此评价，可以对酿酒酵母的筛选提供指导。

表 10 通过回归方程计算得出的梨酒理论评分Table 10 Theoretical scores for pear wine calculated from the regression equation

3 讨 论

已有许多报道表明多酚和总黄酮具有抗氧化性能[9-11,20-24]。在本研究中通过对各变量做偏相关分析得知，多酚质量浓度和总黄酮质量浓度均与铁还原力、DPPH自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01），说明两者对梨酒的抗氧化能力贡献较大。

还原糖、总酸质量浓度均分别与D P P H 自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05）和极显著正相关（P＜0.01），说明糖酸等营养物质参与了抗氧化的过程。阿依姑丽·艾合麦提等[25]报道野山杏的有机酸具有清除自由基的能力。程勇杰等[26]报道树莓酵素和蓝莓酵素均以酒石酸、乙酸和柠檬酸为主，并具有DPPH自由基清除率、羟自由基清除能力。葡萄酒的抗氧化活性不仅与酚类物质有关，还与酒石酸、糖含量等指标存在显著或极显著相关性[27]，这与本研究结果一致。梨酒的主要有机酸为苹果酸、柠檬酸和酒石酸[12]，苹果酸能够捕获自由基，具有抗氧化活性[28]。而柠檬酸和酒石酸则均对板蓝根提取物的抗氧化效果有协同增效作用[29]。梨酒中的有机酸究竟是直接参与抗氧化过程，还是和其他物质协同发挥作用有待于进一步研究。

因子分析是多元变量统计分析中最常用的方法之一，毛园园[30]利用SPSS软件中的主成分分析法对酿酒葡萄理化指标进行筛选，提取了8 个葡萄酒主要因子作为最终的主要理化指标，达到简化数据降低运算量的目的。曹忠威等[31]采用多元线性回归模型构造了酿酒葡萄和葡萄酒理化指标之间的关系，确定了白葡萄酒新的评价指标。赵国群等[12]采用主成分分析对梨酒品质进行评价，认为梨酒中的总酸、总酚、酒石酸、可溶性固形物、还原糖、干浸出物和单宁含量是评价梨酒品质的主要指标，与本研究结果有部分相似之处，但其没有涉及梨酒的抗氧化功能研究。本研究通过因子分析法，把代表梨酒品质和抗氧化功能的9 个变量简化得到了3 个公因子：营养因子、功能因子和风味因子，分别代表了梨酒的营养性、功能性和风味，也符合人们对果酒的评价和消费习惯。

梨酒的综合因子得分与多酚质量浓度、黄酮质量浓度、还原糖质量浓度、总酸质量浓度、铁还原力、DPPH自由基清除能力均呈极显著正相关（P＜0.01）（表8），说明营养成分丰富、具有强抗氧化能力的酒能够获得好的评价，这与实际中的评价标准相符合。也说明本研究所选择的评价指标合理，建立的评价体系可行。但遗憾的是羟自由基清除能力未能在本评价体系中获得很好的体现，推测可能有其他物质参与羟自由基的清除，具体机理还有待后续研究予以揭示。

通过逐步回归分析法建立的梨酒综合品质理论模型可以很好地和通过因子分析建立的评价体系相拟合，说明此模型具有较高的可靠性，期望能够通过此模型的建立简化梨酒的评价参数，同时为筛选酿制优质梨酒的酵母菌种提供指导。

4 结 论

本实验通过因子分析法，对不同酵母酿制梨酒的综合品质进行评价，结果表明LA-BA酵母酿制的梨酒综合品质最好。通过逐步回归法建立了梨酒综合品质评价的理论模型：F’＝-3.123+0.486×F’1+0.980×F’2+0.006×F’3+0.034×F’4，其中F’1、F’2、F’3和F’4分别代表还原糖含量、铁还原力能力、多酚含量和DPPH自由基清除率。此理论模型可以很好地和通过因子分析建立的评价体系相拟合，说明其具有较高的可靠性，期望能够通过此模型的建立简化梨酒的评价参数，同时为筛选酿制优质梨酒的酵母菌种提供指导。