烷过氧自由基氧化对草鱼肌原纤维蛋白热聚集行为的影响

李学鹏，刘慈坤，王金厢，周明言，蔺博燕，李文协，朱文慧，励建荣，林 洪

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心，辽宁 锦州 121013）

草鱼又名鲩鱼，属鲤形目、鲤科、草鱼属，是我国重要淡水经济鱼类之一。2018年我国草鱼养殖产量达550.43万 t，在全国淡水养殖主要鱼类中排第一位[1]。草鱼营养价值高，是一种高蛋白、低脂肪的健康食品，含有丰富的VB1、VB2、烟酸、不饱和脂肪酸，以及钙、磷、铁、锌、硒等微量元素[2]。此外草鱼肉质鲜美且价格低廉，深受广大消费者的喜爱。然而，草鱼肌肉含水量高、肉质嫩、易腐败变质。另外，因含有丰富的多不饱和脂肪酸，在脂肪氧合酶的作用下易发生脂质过氧化反应，导致草鱼在贮藏加工过程中易氧化酸败[3-4]。

脂质过氧化反应较为复杂，其中活性物质主要包括脂质自由基和活性脂质氧化产物，这些活性物质具有氧化蛋白质的能力，可导致蛋白质结构及功能性质的变化[5-7]。已有研究表明，烷过氧自由基是脂质过氧化反应中最主要的自由基中间体，在诱导水产品蛋白质氧化过程中扮演重要角色[8-9]。近年来，由于具有可预测、可控来源等特点，2,2’-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）有氧分解产生的烷过氧自由基模型被广泛用作产生活性氧的诱导剂[10-11]。Wu Wei[12]、Ye Lin[13]、尤翔宇[14]、Zhou Feibai[15]等分别采用AAPH在有氧条件下热降解产生烷过氧自由基氧化大豆蛋白、花生蛋白、米糠蛋白和猪肉蛋白，均发现烷过氧自由基会对这些蛋白质结构和性质产生重要影响，但烷过氧自由基对鱼肉蛋白氧化及对其功能性质影响的研究目前仍鲜见报道。

肌原纤维蛋白是鱼肉的主要组成成分，凝胶性能是肌原纤维蛋白的主要功能特性之一，凝胶质量决定了鱼糜制品的品质。肌原纤维蛋白在热诱导作用下发生变性，并通过二硫键、氢键、疏水相互作用等分子间作用发生交联、聚集和凝胶化，进而形成高度有序的三维网络结构[16]。凝胶网络的质量不仅与肌原纤维蛋白结构性质有关，且受到凝胶过程的影响。热聚集是肌原纤维蛋白凝胶过程中的关键步骤，其行为直接决定凝胶基质的结构和物理化学特性（即凝胶特性）；有序的热聚集有利于形成细致的凝胶网络，反之则易形成粗糙的凝胶结构[17]。大量研究表明，不同自由基和不同氧化途径引起的肌原纤维蛋白氧化均会影响其凝胶性能[18-21]，而氧化对肌原纤维蛋白热聚集行为的影响一直被忽视。鉴于此，本实验采用不同浓度AAPH溶液有氧热分解产生的烷过氧自由基作为氧化体系，对草鱼肌原纤维蛋白进行模拟氧化，获得不同氧化程度的肌原纤维蛋白，并在不同温度条件下进行热处理，研究氧化肌原纤维蛋白溶液在热处理过程中热稳定性、表面疏水性、Zeta电位、内源荧光光谱、浊度、粒径分布、聚集体形貌等变化，分析氧化对鱼肉蛋白的热聚集行为的影响规律，为深入揭示氧化对鱼肉蛋白凝胶性质的影响机制及凝胶品质调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜草鱼购于锦州林西街海鲜批发市场，平均体质量（2 000±30）g。

AAPH（纯度97%） 上海Macklin公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、8-苯胺基-1-萘磺酸铵（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）、氯化钠、氯化钾、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；JHG-Q60-P100型实验室均质机 上海融合公司机械设备有限公司；SORVALL Stratos冷冻高速离心机 美国Thermo公司；2.5L冷冻干燥机 美国Labconco公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-2550紫外-可见光分光光度计岛津仪器（苏州）有限公司；F96Pro荧光分光光度计上海棱光技术仪器有限公司；Nano-ZS90激光粒度仪英国马尔文公司；204 F1差示扫描量热（differential scanning calorimeter，DSC）仪 德国耐驰公司；Dimension Icon原子力显微镜（atomic force microscope，AFM） 美国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 草鱼肌原纤维蛋白的提取

新鲜草鱼电击晕后宰杀、去皮，取背部肌肉绞碎，加入5 倍体积10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），高速均质3 次，每次30 s，4 ℃条件下5 000 r/min离心20 min，取沉淀。上述过程反复3 次，在最后一次沉淀中加入5 倍体积10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2），高速均质，4 ℃下4 500 r/min离心20 min，取上清液备用。采用双缩脲法测定提取的肌原纤维蛋白浓度。

1.3.2 烷过氧自由基氧化肌原纤维蛋白的制备

参考Zhou Feibai等[15]的方法，将制备的肌原纤维蛋白与不同浓度（0、0.2、1.0、5.0 mmol/L）的APPH溶液以体积比2∶1混合，置于37 ℃避光条件下，在恒温水浴中孵化24 h，并充分混匀，使肌原纤维蛋白发生不同程度的氧化。反应结束后，将反应液温度迅速降到4 ℃以下，再将溶液在4 ℃去离子水中透析24 h除去残余未反应的AAPH，之后取部分溶液冷冻干燥制得氧化蛋白用于热稳定性测定，剩余溶液用于其他指标分析。

1.3.3 肌原纤维蛋白热稳定性分析

取5～10 mg冻干的氧化后蛋白样品于铝盒中，采用DSC仪进行测定。参数设定为：初始温度为20 ℃、升温速率为5 ℃/min、结束温度为140 ℃，对照组为空盘子，整个过程需要氮气（0.8～1.0 Pa）保护。采用STAR软件进行数据处理和分析得到DSC曲线。每个样品重复3 次，取平均值。

1.3.4 表面疏水性的测定

参考S a e e d 等[22]的方法并加以修改。将样品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）稀释至0～1 mg/mL，加入25 µL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制）后混合均匀，避光静置10 min，然后用荧光分光光度计测定其荧光强度。测定条件为：激发波长374 nm，狭缝5 nm，扫描范围250～500 nm。以蛋白质量浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，曲线初始斜率即为所求的表面疏水性指数。

1.3.5 Zeta电位的测定

采用Nano-ZS90激光粒度仪Zeta电位分析功能测定热处理后的草鱼肌原纤维蛋白溶液的Zeta电位。测定温度为25 ℃，温度平衡时间2 min，每组测定50～100 次。

1.3.6 内源荧光光谱的测定

将热处理后的蛋白样品质量浓度调整至0.25 mg/mL。采用F96Pro荧光分光光度计在激发波长295 nm条件下得到300～450 nm之间的发射光谱（灵敏度为2）。

1.3.7 浊度的测定

将氧化后肌原纤维蛋白溶液调至2 mg/mL，置于100 mL的烧杯中，用铝箔纸封口，温度计与转子由中心孔插入，以1 ℃/min升温速率水浴加热，水浴温度由30 ℃升至90 ℃，每升高10 ℃取5 mL样液在350 nm波长处测定吸光度。

1.3.8 粒径分布的测定

采用Nano-ZS90激光粒度仪测定蛋白质的粒径分布，先用0.45 μm滤膜过滤不同氧化程度的草鱼肌原纤维蛋白溶液，再配成1 mg/mL。随后将上述不同氧化程度的蛋白溶液分装至具塞试管中进行水浴加热，水浴温度由30 ℃升至90 ℃，每升高10 ℃取5 mL样液，冷却至室温。然后将热变性的蛋白液加入测量池中，测定温度25 ℃，平衡时间1 min。

1.3.9 AFM测试

取2 μL加热后的样品溶液（0.1 g/mL）置于云母片上，用氮吹仪小心吹干。将样品均匀的涂在载玻片上，放置于Dimension Icon AFM载物台进行观察。测试采用轻敲模式。使用Digital Nanoscope 软件分析AFM图片。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS statistics 19软件中的方差分析法进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著，数据绘图采用Origin软件。

2 结果与分析

2.1 AAPH氧化对草鱼肌原纤维蛋白热稳定性的影响

DSC法广泛应用于蛋白质热稳定性研究。在DSC图谱中，最高峰对应的温度为变性的转变温度，直接体现蛋白质的热稳定性；峰面积的积分为变性焓（ΔH），反映蛋白质分子的疏水性或亲水性，同时也反映蛋白质分子的聚集程度，因此可采用DSC表征结构变化所引起的焓变化及样品结构变化信息[23-24]。AAPH氧化后草鱼肌原纤维蛋白DSC分析得到的起始温度、转变温度及ΔH如图1所示，随着AAPH浓度的增加，肌原纤维蛋白起始温度呈现先升高再降低的趋势，转变温度及ΔH变化规律较为一致。与对照组相比，0.2、1.0 mmol/L AAPH处理组的起始温度显著提高（P＜0.05），经5.0 mmol/L AAPH处理后又显著下降（P＜0.05）。另外，1.0 mmol/L AAPH氧化组样品的转变温度较对照组显著提高（P＜0.05）。说明低浓度AAPH（0.2、1.0 mmol/L）氧化使草鱼肌原纤维蛋白的热稳定性增强，而高浓度氧化时使其热稳定性下降。其原因可能是较低浓度AAPH氧化时产生二硫键等作用促进了蛋白质分子交联，提高了热稳定性；高浓度时过度氧化破坏了肌原纤维蛋白结构，使蛋白发生去折叠反应，从而导致热稳定性下降[17]。

图 1 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白的热稳定性Fig. 1 Thermal stability of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH

2.2 AAPH氧化对草鱼肌原纤维热处理过程中表面疏水性变化的影响

图 2 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中表面疏水性的变化Fig. 2 Changes in surface hydrophobicity of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白质的表面疏水性不仅能间接反映蛋白质构象，同时也能够表征蛋白质的溶解度、稳定性及自缔合的能力[25]。热处理过程中，加热会使蛋白质结构变性展开，造成分子内部的疏水性基团暴露出来，导致疏水性增加[26]。不同浓度AAPH氧化的草鱼肌原纤维蛋白加热过程中表面疏水性指数的变化如图2所示。除了50 ℃下0.2 mmol/L AAPH处理的样品外，其他氧化组样品在不同加热温度时的表面疏水性指数均显著高于对照组（P＜0.05），说明AAPH氧化破坏肌原纤维蛋白结构，导致疏水性基团的暴露。随着加热温度的升高，各组样品表面疏水性指数变化趋势大致相同，均呈现先增加后降低趋势。对照组和低浓度AAPH氧化组均在70 ℃表面疏水性指数达到最大值，5.0 mmol/L AAPH氧化组在60 ℃达到最大值。说明对照组和低浓度AAPH氧化组加热到70 ℃时蛋白结构完全展开，而5.0 mmol/L AAPH氧化组样品热稳定性低，60 ℃时已充分展开。继续升高温度，表面疏水性指数下降，可能是聚集体的形成将部分疏水基团重新被包埋所致[26]。蛋白质表面疏水性增加，会使其更容易发生聚集，导致蛋白质溶解度下降，该结果也印证了2.5节肌原纤维蛋白溶液浊度的变化结果。

2.3 AAPH氧化草鱼肌原纤维蛋白热处理过程中表面电位变化的影响

图 3 不同氧化程度的草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中Zeta电位的变化Fig. 3 Changes in zeta potential of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白质的Zeta电位能够反映蛋白表面的所带电荷情况，同时也对聚集体形成和维持体系的稳定性具有重要作用[27]。加热过程中不同浓度AAPH氧化的草鱼肌原纤维蛋白表面电位变化如图3所示，随着温度的升高，不同处理组样品Zeta电位的绝对值均呈先升高再下降的趋势。Zeta电位绝对值的变化趋势基本与表面疏水性指数变化一致，均在60～70 ℃左右达到最大值。这可能是因为热处理过程中，肌原纤维蛋白变性，结构逐步展开，一些原来包埋在分子内部的带电氨基酸残基逐渐暴露使蛋白表面电荷增多；之后肌原纤维蛋白发生热聚集，形成的聚集体又把部分带电氨基酸残基包埋起来，使表面电荷减少[28]。另外，从图中同时可以看出，AAPH氧化后肌原纤维蛋白

Zeta电位绝对值均高于对照组，这可能是烷过氧自由基改变了肌原纤维蛋白表面电荷和氨基酸残基的分布，使得蛋白表面静电作用力失衡。Chen Nannan[29]、Ye Lin[30]、吴伟[31]等发现过氧自由基氧化可使大豆蛋白、花生蛋白和大米蛋白Zeta电位绝对值下降，其变化也与氧化改变蛋白表面电荷和氨基酸残基分布、改变表面吸引力/排斥力分布有关。

2.4 AAPH氧化对草鱼肌原纤维蛋白热处理过程中内源荧光光谱变化的影响

图 4 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中内源荧光光谱的变化Fig. 4 Changes in intrinsic fluorescence spectra of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白质的内源荧光主要来自于色氨酸等芳香族氨基酸残基，通过内源荧光光谱可以了解蛋白分子多肽链空间结构的变化。从图4可以看出，草鱼肌原纤维球蛋白在295 nm激发波长下，色氨酸荧光光谱在335 nm左右有一个强荧光吸收值。随着加热温度的升高，所有处理组样品肌原纤维蛋白荧光强度均逐渐减少，该趋势与Lefevre等[32]的研究结果较为一致。这可能是因为加热后，肌原纤维蛋白变性，结构逐步展开，埋藏在分子内部的色氨酸残基暴露于外部极性的环境，促进聚集体的形成，分子间的疏水性相互作用增强[33]。此外，从图4中还可以看出，AAPH氧化导致肌原纤维蛋白荧光强度下降，且随着加热温度的升高，氧化程度越大的样品肌原纤维蛋白的荧光峰红移现象越明显。红移表示色氨酸的微环境极性增加，即荧光发射基团暴露于高极性的水性环境中。这说明AAPH氧化处理能使肌原纤维蛋白色氨酸的微环境在热聚集过程中变得亲水，蛋白质构象更易发生变化。

2.5 AAPH氧化对草鱼肌原纤维蛋白热处理过程中浊度变化的影响

图 5 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中浊度的变化Fig. 5 Changes in turbidity of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

浊度可以反映溶液中不溶悬浮粒子的大小和数量，常作为蛋白质聚集的测定指标。蛋白质在溶液中发生聚集后，颗粒直径会变大，浊度会升高[34]。不同浓度AAPH氧化肌原纤维蛋白在加热过程中浊度的变化如图5所示，随着温度的升高，不同组样品的浊度总体均先增加，并在达到峰值后略微降低。当样品在40～50 ℃加热时，对照组和低浓度（0.2 mmol/L和1.0 mmol/L）AAPH处理组浊度没有发生显著变化（P＞0.05）。而加热温度达到60 ℃时，对照组和0.2 mmol/L AAPH处理组样品浊度达到最大值；温度达到70 ℃时，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH处理组样品浊度达到最大值，继续升高温度，浊度变化不显著（P＞0.05）。加热过程中肌原纤维蛋白溶液浊度增加说明蛋白发生了变性聚集，溶液中不可溶聚集体的大小和数量均明显增加；当升高到一定温度时，蛋白溶液浊度趋于稳定或略降，是因为随着温度的升高不可溶聚集体颗粒变大，同时可能产生了沉淀，导致溶液中聚集体数量降低[35]。对照组和0.2 mmol/L AAPH氧化组样品浊度在60 ℃时达到最大值，而1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH氧化组样品浊度达到最高值时的温度为70 ℃，且最大浊度均高于对照组，说明AAPH氧化一定程度上改变了肌原纤维蛋白的热聚集规律。分析其可能原因是，肌原纤维蛋白经低浓度AAPH氧化产生二硫键、二聚酪氨酸等作用力并改变了其结构和构象[17]，使其分子链在较低加热温度时难以完全展开、变性和聚集，该结论与热稳定性结果相一致。而高浓度AAPH氧化可能引起肌原纤维蛋白肽链断裂和降解，降解形成的肽链较肌原纤维蛋白分子难以聚集，但随着加热温度的升高，它们可通过非共价键和二硫键等结合形成聚集体，使溶液中不可溶聚集体数量增加，因此高浓度AAPH氧化组浊度达最高值时温度较高、浊度较大。浊度的变化与表面疏水性的结果相一致。

2.6 AAPH氧化对草鱼肌原纤维蛋白热处理过程中粒径分布的影响

图 6 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中粒径分布的变化Fig. 6 Changes in particle size distribution of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白质在一定条件下加热变性，通过次级键和二硫键等形成可溶性聚集体，在一定条件下可溶性聚集体进一步聚集交联就可形成凝胶网络，因此热聚集体的粒径对蛋白质的凝胶性质产生重要影响[36]。加热过程中不同浓度AAPH氧化的草鱼肌原纤维蛋白的粒径分布变化如图6所示，随着加热温度由30 ℃升到90 ℃，对照组样品中热聚集体的平均粒径逐渐增大，说明未氧化草鱼肌原纤维蛋白加热过程中发生了相对有序的热变性聚集。0.2 mmol/L AAPH氧化组样品粒径变化规律基本与对照组一致。1.0 mmol/L AAPH氧化组样品加热过程中粒径变化趋势较为复杂，在30～40 ℃时粒径变化不大，这可能是因为草鱼肌原纤维蛋白经1.0 mmol/L AAPH氧化后热变性温度升高（由2.1节可知其热转变温度为48.75 ℃），蛋白没有发生明显的变性和聚集；加热温度在50～70 ℃时，聚集体粒径随着温度升高逐渐增大；进一步升高温度（80～90 ℃）聚集体粒径又发生了降低。5.0 mmol/L AAPH氧化组样品在40 ℃加热时粒径显著增大，这是由于该氧化样品热变性温度低于40 ℃，故样品在温度达到40 ℃时已发生明显聚集；继续升高温度，聚集体粒径逐渐增大，当加热温度达70 ℃后粒径又有所降低。此外，由图6还可以看出，不同组样品初始平均粒径（30 ℃时）随着AAPH氧化浓度的增加呈现先增加后降低趋势。可见AAPH氧化使草鱼肌原纤维蛋白聚集体粒径发生不规则变化，上述粒径变化规律可能是由于低浓度氧化时蛋白形成可溶性聚集体，而高浓度氧化时部分蛋白形成不可溶性聚集体，AAPH氧化使得肌原纤维蛋白在热变性过程中形成可溶聚集体的能力下降，高温时部分可溶性聚集体可转化为不可溶性聚集体形成沉淀，导致平均粒径降低[37]。

2.7 AAPH氧化对草鱼肌原纤维蛋白热聚集体形貌变化的影响

AFM技术利用纳米级尺寸及pN级力灵敏度的探针在样品表面进行逐级光栅扫描得到样品表面的形貌。利用AFM观察蛋白质聚集过程中微观形态的变化能够直观反映蛋白溶液的聚集状态[38]。不同浓度AAPH氧化的草鱼肌原纤维蛋白加热过程中形成的聚集体形貌如图7所示。未氧化的草鱼肌原纤维蛋白加热过程中聚集体颗粒相对较小且分布均匀，加热温度越高，聚集体的颗粒也越大。经0.2 mmol/L和1.0 mmol/L AAPH氧化处理后的肌原纤维蛋白加热过程中聚集体颗粒也随着加热温度的升高而增大，但形貌特征发生了一定变化，颗粒大小不一、分布不均匀。而且相同温度下，蛋白氧化程度越高形成的聚集体颗粒越大、数量越少。这说明AAPH氧化会使草鱼肌原纤维蛋白发生不规则地热聚集，形成大的不规则蛋白簇，且改变了热聚集体的形貌特征。

图 7 不同氧化程度草鱼肌原纤维蛋白热聚集过程中聚集体AFM形貌Fig. 7 AFM images of heat-induced aggregates of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH

3 结 论

较低浓度（不高于1.0 mmol/L）AAPH氧化处理有助于增强草鱼肌原纤维蛋白的热稳定性，而高浓度（5.0 mmol/L）氧化则降低其热稳定性。随着加热温度的升高，对照组和氧化组样品蛋白溶液的表面疏水性指数、Zeta电位绝对值、浊度呈先增加后降低趋势。内源荧光强度随加热温度的升高逐渐减少并出现红移，且氧化程度越大，红移现象越明显。对照组和0.2 mmol/L AAPH氧化组样品热聚集体的平均粒径随着加热温度的升高逐渐增大，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH氧化组样品则呈先增大后减小趋势。氧化组样品热聚集体大小不一且分布不均匀，随着加热温度的升高聚集体颗粒增大，且氧化程度越高颗粒越大。总之，烷过氧自由基氧化显著影响草鱼肌原纤维蛋白的热变性聚集规律，使其从有序变为无序和不规则，进一步可能会影响肌原纤维蛋白的凝胶性质。