辉光放电等离子体对硫色镰刀菌的杀菌作用

杜明远，龙海涛，田立鹏，付国瑞，毕 阳，蒲陆梅,*

（1.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

镰刀菌（Fusarium）是农作物中一种重要的植物病原真菌[1]。该菌种类繁多、分布范围广，通过寄生或腐生生活，易侵染多种粮食、油料等农作物，引起根腐、茎腐和穗（粒）腐等多种病害，这些病害严重影响了农作物的正常生长及粮食产量，其中以镰刀菌引起的马铃薯干腐病较为常见[2-3]。据报道，中国每年至少有20%的马铃薯因采后病害等原因而烂损，而镰刀菌引起的马铃薯干腐病占贮藏期间真菌性病害的50%以上[4-5]。硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）是引起我国西北地区马铃薯干腐病的主要病原菌之一，并且致病力最强[6-7]。此外，被硫色镰刀菌侵染的马铃薯块茎体内会积累大量单端孢霉烯族毒素[8]，其中以T-2毒素的毒性最强[9]，这类毒素不仅降低了马铃薯的品质，而且还会通过不同的毒性机制对人和动物产生毒性，给人和动物的食用安全带来严重隐患。因此，有效控制和杀灭镰刀菌在马铃薯病害防控领域具有重大意义。

目前，国内外多采用化学防治、生物防治措施对马铃薯干腐病进行预防和控制[10]。较为常用的化学杀菌剂能够有效地控制马铃薯干腐病，但是大多数化学杀菌剂处理会对环境造成污染，农药残留问题严重，而且还会使病原体产生抗药性[11]。生物防治是指通过对镰刀菌具有拮抗作用的菌种（主要有木霉属真菌、非致病尖孢镰刀菌和芽孢杆菌）抑制镰刀菌的生长，从而控制干腐病的发生。然而，微生物之间这种生长抑制作用易受温度、湿度等各种环境因素的影响，并且大多数拮抗菌多为实验室筛选，在自然环境下繁殖能力较弱，对镰刀菌生长抑制作用有限，这些因素制约了该技术在生产实践中广泛应用[12]。因此，寻找一种能代替化学和生物杀菌剂且安全高效、不受环境条件制约、对环境无污染的方法成为关键。

辉光放电等离子体（glow discharge plasma，GDP）作为一种新型的高级氧化技术，是一种能够在水溶液中通过直流放电产生等离子体的电化学方法[13-14]。其原理是利用外加直流电场作用，在特定的电化学反应容器内，当两极间的电压（500～600 V）足够高时，电极与周围电解液之间会持续产生如·OH、·H、H2O2等多种高活性粒子[15]。研究表明，在辉光放电过程中，这些活性粒子就是辐射源，能够影响后续的反应，在电解质溶液中参与化学反应并提供活性中间体[16-17]。有大量文献报道该方法已成功应用于污水处理和有机染料降解[18-21]。另外，还有相关文献报道表明，GDP处理能够高效去除食物中真菌毒素（棒曲霉素、T-2毒素和立枯丝核菌毒素），并且对食物的品质和营养成分影响很小[22-25]；此外，该方法具有操作简单、反应条件温和（常温、常压）、环保无残留物等优点，但是该技术在食物中病原真菌杀灭方面鲜有文献报道。因此，本实验选择硫色镰刀菌为研究对象，研究GDP对硫色镰刀菌孢子的杀灭效果，同时从细胞生物学角度初步考察对该菌的杀菌机理，旨在为GDP技术应用于杀灭食物中镰刀菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）BNCC 117681由甘肃农业大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基自制；马丁氏琼脂培养基的制备参考文献[26]。

葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉上海源叶生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化学试剂有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHP-9272B恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；CX21 FS1C生物显微镜、BX53荧光显微镜 日本奥林巴斯公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；DH1722-6高压直流电源北京大华无线电仪器厂。

GDP杀菌设备（图1）主要包括反应器和高压直流电源两个部分。其中反应器由两根电极组成，阳极是由直径为0.5 mm的铂丝组成，阴极是由直径为1.0 cm的碳棒组成。外部设备冷却水装置控制反应温度，磁力搅拌器促使等离子体中活性成分与电解质溶液充分反应。

图 1 GDP反应系统示意图Fig. 1 Schematic diagram of the GDP experimental apparatus

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

参考潘春青等[27]的方法，将1 mL无菌水滴加至含硫色镰刀菌菌株的斜面培养物中，摇匀，吸取200 μL菌悬液滴加至PDA培养基中心位置，用玻璃棒涂布均匀，26 ℃ 恒温培养5 d后，筛选出生长良好的菌株，用直径为6 mm的打孔器在PDA培养基上打取菌饼，用镊子挑取并接种于新制PDA培养基，26 ℃恒温培养7 d后，4 ℃ 冰箱保存，备用。

1.3.2 孢子悬浮液的制备

参考胡林刚等[5]的方法，取26 ℃培养7 d的硫色镰刀菌培养皿1 个，加入10 mL无菌水，用玻璃涂布棒刮下平板上的硫色镰刀菌孢子，经双层纱布过滤然后转入150 mL锥形瓶中，充分振荡后，移取10 μL滤液滴加到血球计数板计数，显微镜观察计数，用无菌水稀释至所需浓度为2×106个/mL。

1.3.3 GDP处理

取50 mL浓度为2.0×106个/mL的孢子悬浮液，将其加入到辉光放电反应容器中，通过调节电源电压从0逐渐增加到650 V，测定电流强度随电压的变化曲线。根据GDP的特性，确定等离子体产生的条件（电压及电流强度变化范围）在确定的电压及电流强度变化范围内，并在室温、常压条件下对孢子悬浮液进行辉光放电处理。

1.3.4 单因素试验

选取处理电压分别为500、520、540、580、600 V，处理时间分别为3、6、9、12、15、18 min，电极极距分别为1.0、1.5、2.0、2.5 cm，以Na2SO4、NaNO3、NaCl、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液作为电解质，研究GDP处理电压、时间、极距和电解质对硫色镰刀菌杀菌率的影响。

1.3.5 响应面法优化GDP对杀菌效果的影响

参考张志伟[28]的方法，在单因素试验的基础上，设计Box-Behnken实验方案以处理电压（A）、处理时间（B）和电极极距（C）作为响应变量，以杀菌率（Y）作为响应值，设计响应面分析试验，试验因素和水平见表1。

表 1 响应面设计因素-水平表Table 1 Code and level of independent variable used for response surface design

1.3.6 杀菌率测定

通过硫色镰刀菌杀菌率分析各因素对GDP杀菌效果的影响，参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》测定100 μL孢子悬浮液中的孢子存活数量。杀菌率根据下式计算。

式中：N0为GDP处理前硫色镰刀菌菌落数/CFU；N为GDP处理后硫色镰刀菌菌落数/CFU。

1.3.7 验证实验

取50 mL浓度为2.0×106个/mL的孢子悬浮液加入到辉光放电反应容器中，在优化后的最佳GDP工艺条件下处理孢子悬浮液，移取0.5 mL加入到含有4.5 mL无菌水的玻璃试管后，振荡混匀，随后进行10 倍梯度稀释，选择稀释度为103，将孢子悬浮液涂布于马丁氏琼脂培养基，26 ℃培养48 h后进行菌落计数，以未经GDP处理的孢子悬浮液作为对照组进行菌落计数。

1.3.8 生理活性指标测定

取50 mL浓度为2.0×106个/mL的孢子悬浮液加入到辉光放电反应容器中，在优化后的最佳GDP工艺条件下处理孢子悬浮液，测定以下硫色镰刀菌孢子指标，其中以未经GDP处理孢子作为对照。孢子萌发率：参考胡林刚等[5]的方法，通过生物显微镜观察统计孢子萌发数；菌丝生长量：参考燕璐[29]的方法，通过十字交叉法测定菌落直径和菌体干质量；细胞膜渗透性：参考周灵灵等[30]的方法测定孢子悬浮液的相对电导率；孢子孢内物质释放量：参考盖智星等[31]的方法，通过紫外吸收法测定孢子孢内可溶性蛋白和核酸渗漏量；麦角甾醇质量浓度：参考芦慧[32]的方法通过紫外吸收法测定；丙二醛浓度：参考芦慧[32]的方法采用硫代巴比妥酸比色法测定；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色：参考燕璐[29]的方法通过荧光显微镜观察孢子细胞膜完整性。

1.4 数据处理与分析

每组实验均设3 个平行，用Excel 2016软件进行数据计算，用Origin 9.0软件绘图，用Design-Expert 8.06软件进行响应面设计并对数据进行方差分析，用SPSS 21.0软件对实验数据进行多重比较，分析显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 GDP电流强度-电压特征曲线

以硫色镰刀菌孢子悬浮液作为电解液的GDP电流强度-电压特征曲线如图2所示，电流强度随电压的变化可以分为4 个阶段：在AB段，电压处于0～150 V，电流强度随电压的增加而增加，其变化遵循欧姆定律，属于普通的电解水的过程；在BC段，电压处于150～400 V，电流强度随电压的增加而减小，这一现象的产生是由于随电压的增大，在阳极尖端的电流热效应导致阳极附近电解液有一定程度的汽化现象，产生了绝缘性的气泡，并且绝缘性气泡的产生量随着电压的增加而增加；在CD段，电压处于400～520 V，电流强度随电压的增加而出现不稳定的上下波动，这一现象的产生是随着电压进一步增大，在阴极发射出的电子在电场中加速成为高能电子，高能电子与阳极尖端气态水分子发生碰撞，激发气态水分子发生了部分电离所致，并且在该阶段阳极尖端出现了微弱的淡紫色辉光；在DE段，电压处于520～650 V，电流强度随着电压的增加而增加，阳极尖端气泡与高能电子的碰撞加剧，从而促进了气态水分子的进一步电离，并且电离程度随着电压的增加而增大，这一阶段也是产生等离子体的主要阶段，调节电压至540 V，阳极尖端能够观察到非常明显的紫色辉光且比较稳定，因此选择540 V电压作为杀菌电压，此时电流强度变化范围是40～50 mA。

图 2 硫色镰刀菌孢子悬浮液的GDP电流强度-电压特征曲线Fig. 2 Characteristic curve of current against voltage of F. sulphureum spore suspension

2.2 GDP产生条件对硫色镰刀菌孢子的杀菌作用

2.2.1 电压对杀菌率的影响

图 3 电压对硫色镰刀菌孢子杀菌率的影响Fig. 3 Effect of voltage on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由图3可以看出，控制孢子悬液浓度为2.0×106个/mL，在处理时间为9 min、电极极距为2 cm的条件下，随着电压从500 V升高到600 V，GDP对硫色镰刀菌孢子的杀菌效果逐渐增强，600 V时杀菌率为95.93%，而在500 V时杀菌率仅为20.85%，产生这种现象的原因可能是当电压较低时，在阴极发射的电子在电场中加速获取的能量较低，从而与阳极尖端气态水分子发生碰撞，激发气态水分子发生电离产生的活性粒子（·OH、·H、H2O2）[15]较少，最终导致了等离子体的杀菌效果很弱[33]。张铮等[34]研究介质阻挡放电等离子体对葡萄球菌杀灭效果中也指出，提高电极间电场强度可以增强杀菌效果，与本实验结论一致。

2.2.2 处理时间对杀菌率的影响

图 4 处理时间对硫色镰刀菌孢子杀菌率的影响Fig. 4 Effect of treatment time on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由图4可以看出，控制孢子液浓度2.0×106个/mL、处理电压540 V、电极极距2 cm的条件下，GDP对硫色镰刀菌孢子的杀灭作用随着处理时间的延长而增大，当处理18 min后，其杀菌率为85.99%，而处理3 min时，杀菌率仅为18.21%，这与Misra等[35]研究发现通过介质阻挡放电激发产生的等离子体，其杀菌效果随着处理时间的延长先上升后趋于平缓基本一致。

2.2.3 电极极距对杀菌率的影响

图 5 电极极距对硫色镰刀菌孢子杀菌率的影响Fig. 5 Effect of inter-electrode distance on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由图5可以看出，控制孢子液浓度2.0×106个/mL、处理电压540 V、处理时间9 min的条件下，GDP处理对硫色镰刀菌孢子杀灭作用随着电极极距的增加而减小。当电极极距从1.0 cm增加到3.5 cm时，其杀菌率从55.92%减小到9.53%。产生这种现象的原因可能是由于电极极距的增加引起电极两端的电场强度减小，导致阴极发射的电子在电场中加速获取的能量减少，最终导致电子与气态水分子碰撞激发产生的活性粒子减小，所以杀菌率随着电极极距的增加而减小。张铮等[34]在研究介质阻挡放电等离子体杀菌效果时指出，电极极距对杀菌率的影响是通过改变电极间电场强度实现的。

2.2.4 电解质对杀菌率的影响

图 6 电解质对硫色镰刀菌孢子杀菌率的影响Fig. 6 Effect of electrolytic solutions on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由图6可以看出，控制孢子液浓度2.0×106个/mL、处理电压540 V、处理时间9 min、电极极距2 cm的条件下，在4 种不同的电解质溶液中，GDP处理对硫色镰刀菌孢子也具有明显的致死作用。其中在NaCl电解质溶液中GDP的杀菌率最高，达90.14%，这是由于NaCl在放电过程中会生成HClO，而HClO是一种强氧化性物质，具有一定的杀菌作用。夏青[36]在研究NaCl和Na2SO4两种电解质中GDP杀菌效果时，也得出同样的结论。

2.3 响应面试验设计结果

2.3.1 回归方程及方差分析结果

将响应面试验结果（表2）经Design-Expert软件对数据进行回归分析拟合，得到电压、处理时间和电极极距之间的多元二次回归方程：Y＝77.09+12.31A+9.76B-4.28C+10.94AB+3.19AC+2.43BC-8.05A2-9.15B2-6.14C2。

表 2 响应面试验设计及其结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，回归模型显著，失拟项不显著，模型的决定系数R2为0.992 7，校正决定系数为0.983 2，说明该方程拟合较好，能有效反映GDP杀菌效果与电压、处理时间和电极极距间的关系。一次项A、B、C，交互项AB，二次项A2、B2、C2影响极显著，因此电压、处理时间和电极极距对杀菌率的影响不是一般的线性关系。根据F值可知，各因素对杀菌率的影响由强到弱依次是A（电压）＞B（处理时间）＞C（电极极距）。

表 3 响应面试验设计结果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.3.2 响应面试验结果分析及验证实验

2.3.2.1 电压与处理时间交互作用对杀菌率的影响

图 7 电压与时间交互影响杀菌效果的响应面（A）和等高线图（B）Fig. 7 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and time on fungicidal efficiency

由图7A可知，响应面坡度较陡，表明电压和处理时间的交互作用显著。由等高线图（图7B）可知，当电压一定时，杀菌效果随着处理时间的延长而逐渐增强；当处理时间一定时，杀菌效果随着电压的增大而逐渐增强。

2.3.2.2 电压与电极极距交互作用对杀菌率的影响

图 8 电压与电极极距交互影响杀菌效果的响应面（A）和等高线图（B）Fig. 8 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由图8A可知，响应曲面弯曲程度较小，说明处理电压与电极极距交互作用不明显。等高线图（图8B）反映了当处理电压一定时，杀菌率随着处理极距的增大而减小。

2.3.2.3 处理时间与电极极距交互作用对杀菌率的影响

图 9 处理时间与电极极距交互影响杀菌效果的响应面（A）和等高线图（B）Fig. 9 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between time and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由图9A可知，响应曲面趋于平缓，说明时间与电极极距交互作用不明显。等高线图（图9B）反映了当处理时间一定时，杀菌率随着处理电极极距的增加而减小；当电极极距一定时，杀菌率随着处理时间的延长而增大。

2.3.2.4 验证实验结果

对多元二次回归方程经数学分析，得到杀菌率的最大值。确定最优实验条件为电压560 V、时间15 min、电极极距1.55 cm时，理论杀菌率可达92.97%。综合单因素试验及响应面试验结果，将最佳杀菌条件调整为处理电压560 V、处理时间15 min、电极极距1.5 cm。通过验证实验结果，重复3 次最优条件取平均值，得出硫色镰刀菌杀菌率为92.73%，与预测值相差0.24%，处理前后菌落变化比较见图10。

图 10 对照组（A）和处理组（B）菌落比较图Fig. 10 Comparison of colonies between control (A) and treatment (B) groups

2.4 GDP对硫色镰刀菌孢子生理活性的影响

2.4.1 GDP对硫色镰刀菌孢子生长的影响

表 4 GDP对硫色镰刀菌孢子生长的影响Table 4 Effect of GDP on spore growth of F. sulphureum

表4反映了GDP对硫色镰刀菌孢子的生长抑制作用。在最优处理条件下处理后，孢子萌发率、菌落直径及菌体干质量均显著降低（P＜0.05），其分别降低82.01%、37.16 mm、96.30 mg，说明GDP对硫色镰刀菌生长活性的抑制作用显著。

2.4.2 GDP对硫色镰刀菌菌体质膜完整性及氧化损伤程度的影响

相对电导率是反映菌体细胞膜渗透性的重要指标之一，相对电导率越高，说明细胞膜渗透性越大[28]。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，对维持真菌细胞结构和膜的完整性以及膜上一些功能蛋白的正常功能发挥重大作用，因此通过麦角甾醇质量浓度的变化可以间接反映GDP处理对细胞膜完整性的影响[37]。丙二醛为细胞膜过氧化分解的产物，因此可将其含量作为反映细胞膜过氧化损伤程度的重要指标[32]。PI为非膜渗透性荧光染料，质膜完整的细胞中，PI无法正常进入，因此只有细胞膜破坏后细胞才能被染料染色，而正常细胞不能染色[29]。

图 11 PI染色检测孢子细胞膜完整性Fig. 11 Detection of cell membrane integrity in spores by propidium iodide staining

由表5可知，经GDP处理后，相对电导率增加了21.21%，说明细胞膜的选择透过性发生了改变[28]；通过测定胞内可溶性蛋白和核酸渗漏量，发现GDP处理后细胞悬液中两者质量浓度均显著增大，说明细胞膜已经发生了损伤或是出现了破裂，导致细胞内容物流出[34,38]。GDP处理后细胞膜麦角甾醇质量浓度减小了16.87 μg/mL，而丙二醛浓度增加了0.291 μmol/L，结合杜亚楠[39]的研究结果，推断细胞膜很可能是等离子体作用的主要位点，并且与细胞膜上麦角甾醇有密切联系；丙二醛浓度的增加证明细胞膜发生了脂质过氧化反应。最后将GDP处理后的孢子进行PI染色观察，结果如图11所示，可以看出对照组孢子活性良好，没有被PI染色剂染色，而处理组孢子出现了不同程度的荧光染色，染色后荧光强度反映细胞膜渗透性，染色越深说明细胞膜渗透性越大[29]。

3 讨 论

本实验采用的是一种在液相介质中产生等离子体的方式——辉光放电电解。首先通过单因素试验，研究不同因素（电压、处理时间、极距和电解质）对杀菌率的影响；结果发现，电压、处理时间和极距都是影响GDP杀菌效果的有效因素。增加电压、延长处理时间以及减小电极极距都可以提高杀菌效果。通过响应面分析方法建立的硫色镰刀菌杀菌率的二次项数学模型分析得出各因素对杀菌率的影响大小依次是：电压＞处理时间＞电极极距，在电压560 V、电极极距1.5 cm、处理时间15 min的条件下，杀菌率达到92.73%，此时辉光放电对硫色镰刀菌孢子有很好的杀灭效果。

GDP主要包括高活性粒子（·OH、·H、H2O2）、带电离子、高能电子以及能产生电子跃迁发射射线的激发态原子和分子等[15]。关于其杀菌机理，相关文献主要从等离子体物理化学效应和细胞生物学两个方面进行报道。从等离子体物理化学方面来讲，杀菌机理包括高活性粒子（·OH、H2O2）的氧化降解作用[15]；在电场中高能电子和离子对微生物菌体的蚀刻作用[38,40]以及紫外线的辐射作用，但是目前关于紫外线的辐射杀菌作用存在争议[40]。从细胞生物学方面，相关文献不能有效确定等离子体作用于微生物细胞的具体位点（细胞壁、细胞膜、胞内蛋白质、核酸以及细胞器等都有可能是等离子体的作用位点）[41]。

细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换和信息传递的保护屏障，其稳定性是细胞进行正常生理功能的基础[32]。因此，细胞膜是维持细胞活性的重要结构。本研究通过辉光放电处理孢子，发现处理前后等离子体对细胞膜活性的影响非常显著。结果表明，等离子体作用于细胞膜，膜上发生了脂质过氧化，膜的组成成分麦角甾醇质量浓度显著减小，膜的渗透性增大，孢内大分子物质蛋白质和核酸跨膜渗漏到胞外。另外，有大量文献报道关于化学抗菌剂对植物病原真菌的抑菌机理，认为细胞膜是化学抗菌剂作用于植物病原真菌的主要靶点，且与细胞膜上麦角甾醇有密切联系，通过影响细胞膜的渗透性而影响胞内正常的生理生化反应，从而达到抑菌的效果[5,29,31-32,39]。这与等离子体对细胞膜活性的影响结果也相一致。至于是等离子体中何种成分在起作用，以及采用什么作用机制（氧化作用、蚀刻作用、紫外辐射作用），还需要在后续实验中进一步证明。

另外，还有相关文献报道了有机酸、多酚类有机物，如水杨酸、茶多酚等对硫色镰刀菌产毒能力的影响，结果表明这两种有机物对硫色镰刀菌产毒能力的影响均表现出了显著的浓度效应[42-43]。但是关于GDP技术对硫色镰刀菌产毒能力的影响，目前还鲜见相关文献报道，这将在后续实验中进行研究。