高效液相色谱法测定食用槟榔中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的不确定度评定

袁 河 肖晓义, -, 刘 佳 赵志友 - 夏延斌 -

(1. 湖南省槟榔加工与食用安全工程技术研究中心，湖南 湘潭 411100；2. 湖南宾之郎食品科技有限公司检测中心，湖南 湘潭 411100；3. 湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128)

槟榔是棕榈科植物槟榔干燥成熟种子，含有人体所需的生物碱、多酚、氨基酸以及不饱和脂肪酸等多种营养成分和活性成分[1]。槟榔主要种植在中国的海南和台湾，海南95%以上的槟榔以干果的形式直接销往湖南加工成食用槟榔(亦称槟榔嚼块)[2]。食用槟榔在加工过程中，为了保证食用槟榔的安全性和可口性，根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，食用槟榔添加量适用于话化类标准，山梨酸和苯甲酸最大添加量不得超过0.5 g/kg，糖精钠最大添加量不得超过5 g/kg。因此如何客观准确地测量其含量对企业防腐剂的添加具有指导作用，而槟榔成分复杂且加工时会添加数十种添加剂，增加了准确测量的难度。现有研究[3-4]多是检测槟榔中多种食品添加剂的含量，并未对其不确定进行评定。

为了能够直观反映各个分量对测量结果的分散性，试验拟依据GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》开展试验，依据不确定度评定的相关准则[5-6]，建立模型，对整个操作过程中产生不确定度进行分析得到相对标准不确定度。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器及材料

乙酸铵：分析纯，湖南汇虹试剂有限公司；

甲醇：色谱纯，美国天地(TEDIA)试剂公司；

高效液相色谱仪：LC-20A型，配DAD检测器，株式会社岛津制作所；

超声波清洗机：型号KQ-700E，昆山美美超声仪器有限公司；

分析天平：型号EX125DZH，奥豪斯仪器(常州)有限公司；

宾之郎爆珠槟榔：市售；

苯甲酸(CAS号：65-85-0)：99.0%，中国食品药品检定研究院；

山梨酸(CAS号：110-44-1)：99.8%，中国食品药品检定研究院；

糖精钠标准品(CAS号：128-44-9)：99.9%，中国食品药品检定研究院。

1.2 试验过程

采用GB 5009.28—2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中第一法(高效液相色谱法)对食用槟榔中苯甲酸、山梨酸及糖精钠含量进行测定。

准确称取约2 g(精确到0.001 g)试样于50 mL具塞离心管中，加水约25 mL，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后转移至50 mL容量瓶中，于残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，于8 000 r/min离心5 min，将溶液转移到同一容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22 μm滤膜，待液相色谱仪测定。

2 数学模型的建立

试样中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量按式(1)计算：

(1)

式中：

X——食用槟榔中待测组分含量，g/kg；

ρ——样品溶液中待测组分的浓度，mg/L；

V——试样定容体积，mL；

m——试样质量，g。

3 不确定度来源

根据试验方法可知，食用槟榔中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量测定的不确定度包括：① 标准溶液的配制；② 标准曲线的拟合；③ 样品定容；④ 样品称量；⑤ 回收率及仪器随机效应。

4 结果与分析

4.1 标准物质引入的不确定度

分别称取苯甲酸标准品59.32 mg、山梨酸标准品30.55 mg、糖精钠标准品85.69 mg于50 mL容量瓶中，将苯甲酸、山梨酸标准品用甲醇溶解并定容，糖精钠用超纯水溶解定容。从3种标准储备液中分别取5 mL置于同一50 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，即为标准母液。

上述操作中不确定度来源于标准物质纯度、称量及容量瓶定容。

4.1.1 标准物质引入的不确定度 根据中检院给出的标准物质纯度为99.0%，99.8%，99.9%，按矩形分布，则其相对标准不确定度分别为：

4.1.2 称量引入的不确定度 分析天平精确至0.000 01 g，区间半宽度αm=0.005 mg，假设其为矩形分布，标准不确定度为：

称取苯甲酸标准品59.32 mg、山梨酸标准品30.55 mg、糖精钠标准品85.69 mg，则称量产生的相对标准不确定度为：

urel苯(m)= 2.89×10-3/59.32=4.87×10-5；

urel山(m)= 2.89×10-3/30.55=9.46×10-5；

urel糖(m)= 2.89×10-3/85.69=3.37×10-5。

4.1.3 定容引入的不确定度

(1) 容器及移液引入的不确定度：根据中华人民共和国国家计量检定规程[7]，(25±1) ℃时，50 mL单标线容量瓶(A级)容量允差为±0.05 mL，5 mL (B级)单标线移液管允差为0.030 mL，假设其为矩形分布，则

(2) 温度引入的不确定度：实验室温度在(20±5) ℃之间变化，溶液温度与校准温度(20 ℃)不同所引起的变化为5 ℃×2.08×10-4℃-1=1.04×10-3(2.08×10-4℃-1为水的膨胀系数)，假设其为矩形分布，则

温度对定容体积影响所引入的不确定度为：

定容及移液引入的相对标准不确定度为：

由此得出标准物质的配制引入的相对标准不确定度为：

4.2 绘制工作曲线引入的相对标准不确定度

4.2.1 移取定容引入的不确定度

(1) 移液管引入的不确定度：分别用10 mL移液管准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠混合标准中间溶液0.5，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入超纯水定容至刻度，摇匀后配制成苯甲酸浓度为5.9，13.7，47.5，71.2，94.9，118.6 mg/L；山梨酸浓度为3.1，12.2，24.4，36.7，48.9，61.1 mg/L；糖精钠浓度为8.6，34.3，68.6，102.8，137.1，171.4 mg/L的混合标准工作液。10 mL分度移液管(A级)允差为±0.02 mL，假设其为矩形分布，则

(2) 容量瓶引入的不确定度：10 mL单标线容量瓶(A级)容量允差为±0.025 mL，假设其为矩形分布，则

移取定容引入的相对标准不确定度为：

4.2.2 标准曲线拟合引入的不确定度 根据HPLC检出浓度和峰面积之间的关系如表1所示。

表1 浓度与峰面积关系

采用最小二乘法对浓度x和峰面积y进行线性回归计算，得到苯甲酸标准曲线为y=32.534 7x-6.605 2，r=0.999 9；山梨酸标准曲线为y=63.799 7x-16.607 3，r=0.999 8；糖精钠标准曲线为y=22.411 4x-1.719 2，r=0.999 9。

则由标准曲线拟合引入的标准不确定度为：

(2)

式中：

s(A)——工作液峰面积残差的标准差；

Scc——溶液含量残差的平方和；

n——测量次数；

p——浓度梯度，mg/L；

a——标准曲线的斜率，苯甲酸、山梨酸、糖精钠斜率分别为32.534 7，63.799 7，22.411 4；

b——标准曲线截距，苯甲酸、山梨酸、糖精钠截距分别为6.605 2，16.607 3，1.719 2。

标准曲线拟合得相对标准不确定度按式(3)计算：

(3)

标准不确定度u(q)和相对标准不确定度urel(q)如表2 所示。

表2 标准曲线不确定度结果分析

由此得出标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

4.3 定容引入的相对标准不确定度

4.3.1 容器定容引入的不确定度 样品溶液定容于25 mL

容量瓶中，容量瓶(量入式，A级)容量允差为±0.03 mL，按矩形分布，则

4.3.2 温度引入的不确定度 温度代入的体积影响为25 mL×5 ℃×2.08×10-4℃-1=2.6×10-2mL，假设为矩形分布，则

样品定容引入的相对标准不确定度为：

4.4 称量引入的相对标准不确定度

称取粉碎后的宾之郎爆珠槟榔2 g，考虑到称量分两次进行，分析天平最大的允差为0.000 5 g，假设为矩形分布，则

4.5 提取过程对样品回收率影响引入的相对标准不确定度

(4)

(5)

(6)

(7)

式中：

n——测量次数，n=9。

经计算提取过程不确定度结果如表3所示。

表3 提取过程不确定度结果分析

4.6 随机效应引入的相对标准不确定度

用同一样品做6个平行得到苯甲酸、山梨酸、糖精钠的平均含量，取矩形分布，则

(8)

urel(crep)=u(crep)/c。

(9)

经计算随机效应不确定度结果如表4所示。

表4 随机效应不确定度结果分析

4.7 合成标准不确定度

综上所述，相对标准不确定度如表5所示。

表5 各个分量相对标准不确定度汇总

上述各分量相对不确定度合成标准不确定度为：

4.8 扩展不确定度

在95%置信区间下，取包含因子k=2，得相对扩展不确定度为：

Urel苯(X)=k×urel(x)=2×0.049 3=0.098 6；

Urel山(X)=k×urel(x)=2×0.059 0=0.118；

Urel糖(X)=k×urel(x)=2×0.030 8=0.061 6。

得扩展不确定度为：

U苯=0.043 8 g/kg×0.098 6=0.004 10 g/kg；

U山=0.260 g/kg×0.118=0.030 7 g/kg；

U糖=3.25 g/kg×0.061 6=0.200 g/kg。

综上可得：食用槟榔中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量测定结果为：

X苯=(0.043 8±0.004 10) g/kg (k=2)；

X山=(0.260±0.030 7) g/kg (k=2)；

X糖=(3.25±0.200) g/kg (k=2)。

5 结论

通过对食用槟榔检测过程中标准溶液配制、标准曲线拟合、样品定容、样品称量、回收率及仪器随机效应产生的不确定度进行分析。测定苯甲酸含量中标准曲线拟合和随机效应代入的不确定度分别为67.5%，17.9%；测定山梨酸和糖精钠含量中标准曲线拟合的不确定度分别为80.7%，10.1%，提取过程代入的不确定度分别为70.2%，15.8%。因此在今后的检测工作中，针对标准曲线拟合代入不确定度的问题应该增加标准系列储备液的测定次数、使用精密度更高的量器具和合理确定标液浓度的区间范围；其次是随机效应和提取过程代入的不确定度的问题应该加强操作人员的熟练度、规范试验操作，减少人为因素对提取过程的影响，从而提高检测结果的准确性。