人工老化处理对芥蓝种子生理生化特性的影响

屈煜莹，黄 鑫，徐强辉，何绍恒，柴喜荣，康云艳，杨 暹，赵普艳

(1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642； 2.广州市农业机械化技术推广站，广东 广州 510405)

种子活力是衡量种子质量的指标之一，是确保植物在田间快速和整齐出苗的核心因素，主要表现为种子承受长期储存的能力和应对有害物质的产生导致种子老化的能力[1]。一般认为，活力高的种子更早萌发，有较高的发芽率，并且在逆境中生长优势与潜力更显著。种子寿命主要由自身的遗传特性、种子发育期间的环境因素、贮藏条件以及与种子寿命有关的基因决定[2]，并且种子活力和种子产量的加性基因效应比非加性效应更为普遍，可以改善种子活力、种子产量和种子质量[3]。因此，防止种子劣变或在储藏期间减少种子活力的损秏，对季节性变化的生产至关重要[4]。通过对种子生理生化指标变化及相关基因的研究，了解调控种子寿命的生理及分子机制，对减缓种子老化进程和延长种子寿命具有重要意义。

一般认为，膜脂过氧化作用以及自由基增生是引起种子发生劣变老化的主要原因。种子劣变过程中，细胞膜透性增加、合成代谢能力下降、线粒体形态改变，同时SOD、POD和过氧化氢酶(CAT)等保护性酶的活性降低[2,5]。研究表明，活性氧ROS在调控种子的休眠、胚乳的活动和促进贮藏物的代谢中有一定作用，ROS的过度积累将转变为有害物质，抑制种子萌发，通过抗氧化系统的激活可以清除ROS[6]。朱诚等研究认为，ROS在破坏生物大分子水膜的连续界面时，暴露了生物膜，并且容易受到活性氧自由基的攻击，使贮藏期间的种子膜脂过氧化作用加强，并且不断积累有毒物质，导致种子活力下降[7]。适度降低种子的水分含量，可以降低膜脂过氧化的程度，从而保持种子活力。薄丽萍对不结球白菜种子进行人工老化处理发现，随着老化时间的增加，种子SOD和CAT活性均降低[8]。顾炳朝等发现，在人工老化的后期，POD、SOD和CAT等抗氧化酶活性均下降，种子消除过氧化氢的能力也降低，从而导致过氧化氢的积累[9]。

芥蓝是华南地区重要的特色蔬菜之一。芥蓝的种子寿命较短，华南地区高温高湿频发的条件，不利于芥蓝种子活力的长期保持。目前，关于芥蓝种子活力的研究很少，因此，本试验采用人工老化处理方法，研究不同遗传特性的芥蓝种子在不同时间老化处理下的种子活力及生理生化特性，通过分析种子活力及生理生化的变化规律，以期揭示种子的劣变机理，筛选种子活力相关指标，为延缓种子老化进程和延长种子寿命提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以5个芥蓝品种为试验材料，分别为1号(黄花粗条大苔芥兰)、2号(翠美芥兰F1)、3号(绿宝芥蓝)、4号(夏翠芥蓝)和5号(翠丰芥兰)。试验于2019年上半年在华南农业大学园艺学院进行。

1.2 试验方法

1.2.1种子人工老化

芥蓝种子的人工加速老化处理，参考郑光华等[10]的方法。将芥蓝种子放于40 ℃、相对湿度为100%的培养条件下，分别进行0、2、4、6、8 d的老化处理，获得不同老化程度的种子。

1.2.2种子活力的测定

在进行人工老化处理实验之前，对芥蓝种子和干燥器等工具进行清洗和消毒。其中种子采用10%的NaOCl浸泡10 min进行消毒。将干燥器放入40 ℃恒温培养箱1 d平衡温度之后，在纱布上放入已消毒的芥蓝种子进行高温处理。处理完成后，取出种子放在阴凉环境下干燥1～2 d。取干燥的种子平铺在培养皿中进行发芽率的测定，发芽条件设定为20 ℃、无光照，实验进行3次重复。在第3、4、5、7天分别记录种子的发芽粒数。第7天统计发芽率，并对各处理随机选取长势优良的幼苗，测量其下胚轴长度，根据测定的种子发芽数和下胚轴长度，计算种子的活力指数。

发芽势(%)=(4 d时发芽总数÷90)×100%；

发芽率(%)=(7 d时发芽总数÷90)×100%；

活力指数=∑(Gt/Dt)×S/100%。

式中：Gt为第t日种子的发芽数，Dt为相应的发芽天数，S为平均下胚轴长(cm)。

1.2.3生理指标的测定

通过对芥蓝种子发芽势、发芽率和种子活力的测定，筛选出3号绿宝芥蓝、4号夏翠芥蓝、5号翠丰芥兰进行生理生化指标的测定。

相对电导率测定：称取各处理干种子材料0.3 g，用蒸馏水冲洗3次，并用滤纸吸干种子表面的水分。将种子装入试管中加入50 mL蒸馏水充分混匀，放置在20 ℃环境条件下浸泡12 h，用电导率仪DDS-307测定浸出液电导率。将种子及其浸泡液放置在100 ℃水浴锅中煮沸10 min，冷却至室温后测定煮沸后的浸出液电导率。并计算相对电导率。

采用蒽酮比色法[11]、考马斯亮蓝G-250染色法[11]、硫代巴比妥酸(TBA)法[11]分别测定种子的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和MDA含量。采用NBT法[12]和愈创木酚法[12]分别测定SOD活性和POD活性。

1.3 数据分析

利用Excel软件进行数据计算和作图，利用SPSS 19.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 人工老化对芥蓝种子发芽势、发芽率和种子活力的影响

由图1可以看出，供试品种发芽势均随老化处理时间的延长而降低。其中2号和5号品种发芽势缓慢降低，4号品种次之，1号和3号品种在4 d时发芽势表现出更大的下降程度。老化处理0 d时，5个品种发芽势差距不大，均在80%左右。老化处理2 d时，1号和5号品种发芽势均在70%以上，而2号品种发芽势最低(为51.11%)。老化处理4 d时，2号、4号、5号品种发芽势稳定在40%以上，其中5号品种发芽势最高(达62.22%)。而1号和3号品种发芽势出现急剧降低，3号品种发芽势降低至3.33%，说明在2～4 d的老化处理期间，种子已明显受到高温高湿环境影响，种子生活力降低。老化处理6 d后，2号和5号品种发芽势较高，1号和4号品种发芽势较低，3号品种种子已丧失生活力。老化处理8 d后，5号品种发芽势最高(达18.89%)，3号品种发芽势最低(为0)。

图1 人工老化处理下芥蓝种子的发芽势

由图2可以看出，1、2、3、4、5号品种发芽率均随老化处理时间的延长而降低。0 d老化处理中，5个品种发芽率均在80%以上，5号品种发芽率达93.33%。2 d老化处理中，1号和5号品种发芽率均在80%以上，而2号品种发芽率最低(为68.89%)。4 d老化处理中，2号和5号品种发芽率稳定在60%以上，4号品种次之(为48.89%)。而1号和3号品种发芽率出现急剧降低，3号品种发芽率降低至3.33%。6 d老化处理中，2号和5号品种发芽率较高，1号和4号品种发芽率较低，3号品种种子已不表现生活力。8 d老化处理中，5号品种发芽率最高(达24.45%)，3号品种发芽率最低(为0)。

由图3可以看出，5个品种活力指数均随老化处理时间的延长而降低。其中2号和5号品种缓慢降低，4号品种次之，1号和3号品种在4 d时活力指数显示急速降低。0 d老化处理中，5个品种活力指数均在70以上。2号品种活力指数最高(为90.04)。2 d老化处理中，1、3、4、5号品种活力指数均在60以上，而2号品种活力指数最低(为50.27)。4 d老化处理中，2号、5号品种活力指数稳定在40以上，其中5号品种活力指数达到56.06，4号品种次之，活力指数为34.58，而1号和3号品种活力指数出现急剧降低，1号品种活力指数降低至12.87，3号品种活力指数降低至0.22，说明在2～4 d的老化处理期间内，种子活力降低已没有实际应用价值。6 d老化处理中，2号和5号品种活力指数较高，1号和4号品种活力指数较低，3号品种种子已无活力。8 d老化处理中，5号品种活力指数最高(达13.26)，1号和4号品种活力指数几乎为0，3号品种活力指数最低(为0)。

图2 人工老化处理下芥蓝种子的发芽率

图3 人工老化处理下芥蓝种子的种子活力

2.2 人工老化对芥蓝种子相对电导率的影响

由图4可看出，3、4、5号品种的相对电导率均随老化处理时间的延长而增加。其中3号品种增加趋势明显，4号次之，5号增加趋势缓慢。在0 d处理中，3号品种相对电导率为36%，4号品种为38%，5号品种为43%。在3 d处理中，3号品种相对电导率增加幅度最大(为29%)，5号品种增加幅度最小(为10%)。在6 d处理中，3号品种相对电导率达到最大(为83%)，相对于0 d处理增加幅度为47%，4号品种次之，增加幅度为39%，5号品种增加幅度最小(为29%)。

2.3 人工老化对芥蓝种子可溶性糖含量的影响

由图5可看出，3号、5号品种的可溶性糖含量均随老化处理时间的延长而降低。其中3号品种降低趋势明显，4号品种表现出先增后降，5号品种降低趋势缓慢。在0 d处理中，3号品种可溶性糖含量为6.62%，4号品种为4.72%，5号品种为5.00%。在3 d处理中，3号品种可溶性糖含量降低幅度为1.6%，4号品种有所提升(增幅为0.66%)，5号品种降低幅度最小(为1.02%)。在6 d处理中，3号品种可溶性糖含量相对于0 d处理降低了3.94%，4号品种相对于3 d处理降低幅度2%，5号品种降低幅度为2.18%。

图4 人工老化处理下芥蓝种子的相对电导率

图5 人工老化处理下芥蓝种子的可溶性糖含量

2.4 人工老化对芥蓝种子可溶性蛋白含量的影响

由图6可看出，3号、5号品种的可溶性糖含量均随老化处理时间的延长而升高。其中3号品种增加趋势明显，4号品种表现出先降后增的变化趋势，5号品种增加趋势缓慢。在0 d处理中，3号品种可溶性蛋白含量为0.44 mg·g-1，4号品种为0.74 mg·g-1，5号品种为0.53 mg·g-1。在3 d处理中，3号品种可溶性蛋白含量增加幅度为32%，4号品种有所降低(减幅为9.00%)，5号品种增加幅度最小(为9.00%)。在6 d处理中，3号品种可溶性蛋白含量相对于0 d处理增加了87%，4号品种相对于3 d处理增加幅度为53%，5号品种相对于0 d处理增加幅度为55%。

2.5 人工老化对芥蓝种子MDA含量的影响

由图7可看出，3、4、5号品种的MDA含量均随老化处理时间的延长而升高。其中3号品种增加趋势明显，4号品种次之，5号品种增加趋势缓慢。在0 d处理中，3号品种MDA含量为2.76μmol·g-1，4号品种为3.85μmol·g-1，5号品种为2.15μmol·g-1。在3 d处理中，3号品种MDA含量增加幅度最大，4号品种增加幅度最小。在6 d处理中，3号品种MDA含量相对于0 d处理增加了5.18μmol·g-1，4号品种相对于0 d处理增加了2μmol·g-1，5号品种相对于0 d处理增加了1.96μmol·g-1。

图6 人工老化处理下芥蓝种子的可溶性蛋白含量

图7 人工老化处理下芥蓝种子的MDA含量

2.6 人工老化对芥蓝种子SOD活性的影响

由图8可看出，3、4、5号品种的SOD活性均随老化处理时间的延长表现出先升高后降低的变化趋势。其中3号品种降低趋势明显，4号品种次之，5号品种则是缓慢上升。在0 d处理中，3号品种为9.44 U·mg-1，4号品种为10.54 U·mg-1，5号品种为8.40 U·mg-1。在3 d处理中，3号品种增加幅度最小，4号品种增加幅度次之，5号品种增加幅度最大。在6 d处理中，3号品种相对于3 d处理降低了1.15 U·mg-1，4号品种相对于3 d处理降低了0.19 U·mg-1。5号品种继续缓慢增加。

2.7 人工老化对芥蓝种子POD活性的影响

由图9可看出，3、4、5号品种的POD活性均随老化处理时间的延长表现出降低的变化趋势。其中3号品种降低趋势明显，4号品种次之，5号品种缓慢下降。在0 d处理中，3号品种POD活性为250 U·(g·min)-1，4号品种为225 U·(g·min)-1，5号品种为262 U·(g·min)-1。在3 d处理中，3号品种POD活性降低幅度最大，4号品种次之，5号品种POD活性降低幅度最小。在6 d处理中，3号品种POD活性相比于0 d处理降低了243.75 U·(g·min)-1，4号品种相对于0 d处理降低了177.08 U·(g·min)-1，5号品种POD活性降低了135.42 U·(g·min)-1。

图8 人工老化处理下芥蓝种子的SOD活性

图9 人工老化处理下芥蓝种子的POD活性

3 讨 论

随着人工老化处理时间的延长，种子内部会发生物质和能量代谢的变化以及生理生化的劣变，这些代谢产物的积累导致种子活力进一步降低，并直接抑制萌发[13]。其中，种子生活力是种子潜在发芽能力的标准之一，并且与种子的发育、储藏以及萌发等生理活性密切相关。发芽率、发芽势和发芽指数通常用于生产上测定种子的生活力[14]。M.Massimi发现，在种子加速老化试验后，大粒种子在发芽中显著优于中小粒种子，表现为小粒种子发芽率最低[15]。本试验通过对芥蓝种子进行高温高湿老化处理，发现随着老化处理时间的延长，种子发芽势、发芽率以及种子活力均下降。这与鲜萱等[16]、孙春青等[17]的研究结果一致。

活性氧(ROS)是通过诱导质膜上的过氧化作用而降低膜完整性的重要因素[18]。ROS的积累和自由移动以及保护酶活性的减弱，是引起种子细胞质膜完整性下降的重要因素之一。当外部环境条件合适时，引起质膜完整性降低的因素可能是由磷脂酶和脂氧合酶的活化引起的酶促反应。同时，老化种子的发芽率显著下降与膜脂质过氧化程度显著正相关[13]。蔡春菊等推测，丙二醛将结合保护酶，例如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，这将导致保护酶的空间构象发生变化，自由基积累和膜脂质过氧化[19]。随着试验中老化处理时间的延长，相对电导率和丙二醛含量都呈上升趋势。这与孙守江等[20]、张海娇等[21]的研究结果一致。表明在高温高湿处理下，ROS破坏了细胞膜的完整性，导致膜脂质过氧化程度加快，从而增加了相对电导率和丙二醛含量。

本试验结果显示，可溶性糖含量随着老化处理时间的延长而降低。彭建等认为，种子在高温环境或高湿环境的贮藏过程中，呼吸作用明显加强，进而导致糖代谢加快[27]。因此，在高温胁迫下，种子的可溶性糖含量有所下降。而可溶性蛋白含量随着老化处理时间的延长而增加。这与成广雷等[28]和孙春青等[17]的研究结果相反。可能由于处理时间不够，延长时间能更明显地看出两者之间的相关关系。王鹤冰等发现，芥菜种子可溶性蛋白含量在种子老化2～6 d的时期，有一个短暂的回升过程[29]。这可能是种子在老化过程中有不同的水解酶产生，从而合成新的蛋白质引起的。

4 结 论

本研究以5种芥蓝种子为材料，采用40 ℃、100%相对湿度进行高温高湿人工加速老化的处理方法，研究老化对芥蓝种子发芽势、发芽率、种子活力以及生理生化指标的变化规律。结果表明，随着老化处理时间的延长，发芽势、发芽率和种子活力都有明显的下降趋势。且3号品种种子下降幅度最大，5号品种种子下降幅度最小。相对电导率以及MDA含量随老化处理时间的延长而增加，表现为3号品种增加幅度最大，5号品种增加幅度最小。SOD活性随种子老化处理时间的延长出现先增加后降低的变化趋势，3号品种较5号品种而言清除自由基及过氧化物的能力弱。POD活性随种子老化处理时间的延长出现降低的变化趋势，且5号品种清除自由基及过氧化物的能力较强。可溶性糖含量随种子老化处理时间的延长出现降低的变化趋势，而可溶性蛋白则出现增加的变化趋势，原因在于老化过程中有不同的水解酶产生，进而合成新的蛋白质。通过生理层面对老化的芥蓝种子进行研究得知种子内部是一个复杂的动态结构，逆境的发生影响了种子活力的表达。因此，以生理特性作为研究的基础，利用分子机制进一步研究种子活力关键基因的表达，以期更充分的掌握种子劣变机理。