高灵敏双波长吸收光谱法测定药物中维生素B12

2020-09-17刘殷子顺

分析科学学报 2020年4期

江虹, 刘殷子顺, 李琴

(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

维生素是维持人体正常代谢所必须的一类生物活性物质，而维生素B12是不可缺少的一种重要维生素。人体内维生素B12过多或不足，都会使人体患上某些疾病，如果维生素B12缺乏，人体可能出现恶性贫血、抵抗力降低、肝功能和消化功能障碍、脑障碍等；如果维生素B12过量，则可能产生皮肤过敏反应，甚至休克等。因此，人体内所含维生素B12应适量。为了提高临床用药效果，研究药物中维生素B12含量的快速检测方法具有一定意义。

目前维生素B12的检测方法主要为：紫外分光光度法[1]、高效液相色谱法[2 - 5]、液-质联用法[6 - 8]、电化学法[9 - 11]和荧光法[12]等。我国药典采用的是紫外分光光度法，该法虽然具有简便、快速的优点，但灵敏度一般。其它方法，有的前处理麻烦、所用仪器价格较贵、日常维护费用高、不易普及，有的需特殊材料或者条件要求较高等。本工作借铬天青S与维生素B12能在一定的酸度条件下发生离子缔合反应来检测维生素B12的含量，具有高的灵敏度(比药典法高1个数量级)，且方法简便、快速，适于药物中维生素B12的定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

U-4100型紫外-可见-近红外光谱仪(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

维生素B12(VB12，批号：100248-201504，中国食品药品检定研究院)标准溶液：准确称取适量VB12对照品，加水溶解后转入500 mL棕色容量瓶中，用水稀至刻度，配成135.5 mg/L标准溶液，冰箱4 ℃避光保存。铬天青S(CMS，成都贝斯特试剂有限公司)溶液：1.0×10-3mol/L水溶液。pH=3.2～8.5的Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl溶液：取适量0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L Tris混合，用酸度计测定。所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

样品：市售不同生产厂家的VB12片(编为1#和2#)。

1.2 样液制备

取1#和2#VB12药片各20片，避光去糖衣后，分别置于小烧杯中，加适量水溶解、搅拌、超声10 min，过滤，滤液置于50 mL棕色容量瓶中，用水定容，待用。

1.3 吸光度的测定方法

准确移取VB12标准溶液(或样液)适量于10 mL比色管中，加入pH=4.70 Tris-HCl溶液1.00 mL和CMS溶液2.00 mL，用水稀至刻度，摇匀，5 min后，以试剂空白作参比，扫描溶液的吸收光谱，在波长514 nm和410 nm处，用单波长法测定溶液的吸光度A，再以410 nm作参比波长，514 nm作测定波长，用双波长法测定溶液的吸光度A514+410。

2 结果与讨论

图1 CMS与VB12的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of CMS and VB121.13.6 mg/L VB12,against water;2.1.0×10-5 mol/L CMS,against water;3 - 5.2.71,8.13,13.6 mg/L VB12-2.0×10-4 mol/L CMS,against reagent blank;pH=4.70.

2.1 VB12-CMS的吸收光谱特征

VB12、CMS及它们的缔合物的吸收光谱见图1。图中曲线1表明，在可见光区VB12溶液(13.6 mg/L)有弱吸收:CMS(1.0×10-5mol/L)的酸性(pH=4.70)溶液有较强吸收，最大吸收波长位于496 nm(曲线2)。当在CMS的酸性溶液中加入VB12标准溶液后，由于CMS的结构中含有2个羧酸根离子和1个磺酸根离子，因此它在溶液中是以阴离子形式存在，而VB12结构上有多个含孤对电子的N原子，可接受质子，在溶液中以阳离子形式存在，当二者混合时则以静电引力相互作用生成离子缔合物。生成的新物质在可见光区出现1个强的正吸收峰和1个强的负吸收峰，正吸收峰位于514 nm，红移18 nm，负吸收峰位于410 nm，紫移86 nm，体系的波移进一步说明VB12与CMS发生反应生成新物质。在最大正吸收峰和最大负吸收峰处，体系的吸光度绝对值|A|随VB12质量浓度的增加呈线性增强，VB12在一定浓度范围内服从朗伯-比尔定律。因此，410 nm和514 nm均可用作单波长法测定VB12的测定波长。若以410 nm作为参比波长，514 nm作为测定波长，体系溶液的吸光度A与一定浓度范围的VB12的质量浓度仍呈线性关系，遵从朗伯-比尔定律，且双波长法的灵敏度约是单波长法的2倍，是药典法[1]的10.3倍。

图2 缓冲溶液pH(A)及用量(B)对|A|的影响Fig.2 Effect of pH buffer(A) and amount(B) on |A|

2.2 适宜条件的选择

2.2.1 酸度及用量考察了VB12标准溶液为1.00 mL、CMS溶液为2.00 mL时，1.00 mL不同pH的Tris-HCl溶液对用双波长法测定时对体系|A|的影响，结果见图2A。误差线(n=4)表明，用双波长法测定的最佳酸度为pH=4.70，大于或小于该pH值，体系的|A|或多或少有所降低，方法的灵敏度随之降低，因此实验用pH=4.70作为VB12与CMS的反应介质。实验在原有条件下，考察了pH=4.70缓冲溶液不同用量时对体系|A|的影响，结果见图2B。误差线(n=4)表明，用双波长法测定时pH=4.70的Tris-HCl缓冲溶液最佳用量为1.00 mL，大于或小于该值，|A|均有所降低，方法的灵敏度有所降低。故实验用1.00 mL pH=4.70的Tris-HCl缓冲溶液来控制VB12与CMS反应的酸度。

图3 CMS浓度对|A|的影响Fig.3 Effect of CMS concentration on |A|

2.2.2 铬天青S的浓度固定VB12标准溶液为1.00 mL、pH=4.70 Tris-HCl溶液1.00 mL时，考察了不同浓度的CMS溶液对用双波长法测定时对体系|A|的影响，结果见图3。误差线(n=4)表明，CMS溶液的最佳浓度为2.0×10-4mol/L，大于或小于该值，体系|A|或多或少有所降低，方法的灵敏度随之降低。故实验选用2.00 mL 1.0×10-3mol/L CMS溶液。

2.2.3 试剂加入顺序固定VB12标准溶液为1.00 mL、pH=4.70 Tris-HCl溶液1.00 mL、CMS溶液2.00 mL时，考察了试剂的不同加入顺序对体系|A|的影响。结果表明，当试剂的加入顺序为：VB12、Tris-HCl、CMS时，体系的|A|相对最大，灵敏度最高。故实验按该最佳顺序加入各试剂溶液。

2.2.4 反应速度及稳定性固定VB12标准溶液为1.00 mL、pH=4.70的Tris-HCl溶液1.00 mL、CMS溶液2.00 mL，以及按最佳顺序加入各试剂溶液时，考察了VB12与CMS的反应时间对体系|A|的影响。实验表明，VB12与CMS的反应在5 min内即可完成，5～70 min时，|A|变化很小，即VB12与CMS反应生成的缔合物的稳定时间至少1 h。实验选在10 min后测定。

2.3 标准曲线及相关参数

配制0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL VB12的标准系列溶液，并按1.3的测定方法扫描标准系列溶液的吸收光谱，用双波长法测定各溶液的吸光度A，作标准曲线，其线性回归方程为：A=-0.000910+0.1910c，相关系数r=0.9995(表观摩尔吸光系数ε=2.59×105L/(mol·cm)，检出限为0.030 mg/L。

2.4 共存物质的影响

2.5 分析应用

取1.2下制得的1#和2#待测样液各3.00 mL，按1.3的测定方法对各样品平行测定5份，根据谱图及双波长法回归方程，计算各待测样液及原始样品中VB12的含量。再用双波长法做3个不同加标水平的回收试验，各水平平行测定5份。最后根据回收试验及平行测定结果的相对标准偏差(RSD)判断方法的准确度和精密度。结果见表1。