新型磁性分子印迹聚合物的制备及其对诺氟沙星的表面增强拉曼光谱检测

李笑轩， 李利军*， 何雨涵， 程 昊， 冯 军

(1.广西糖资源绿色加工重点实验室,广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州 545006；2.蔗糖产业省部共建协同创新中心,广西南宁 530004)

诺氟沙星(Norfloxacin,NOFX)属于喹诺酮类抗生素药物，由于其具有良好的抗菌性能和广泛的抗菌谱，被大量应用于临床治疗、畜牧养殖和园艺等领域[1 - 3]。然而，抗生素药物的滥用已经严重威胁到环境和人类健康[4]。到目前为止，虽然有多种抗生素的检测方法，如毛细管气相法[5]、间接荧光免疫分析法[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]等。但这些方法大多存在步骤繁琐、耗时长等缺点，因此，研究抗生素高效、快速及准确的检测方法具有重要意义。

分子印迹聚合物(MIPs)由于其可以在复杂样品中特异性识别目标分子而受到广泛关注，但该技术存在难以富集、不易分离等缺点[8,9]。将磁性基底与分子印迹技术相结合，使得聚合物不仅具有良好的富集效果，还避免了繁琐的离心、抽滤等步骤[10]。氧化石墨烯(GO)具有极大的比表面积，并且表面存在大量可以与金属相连的官能团[11]，因此采用Fe3O4/GO/Ag作为基底材料，可以很好地与分子印迹及SERS技术相结合，实现目标药品的快速、准确、痕量及无免疫检测。除此之外，盐酸多巴胺可以在弱碱条件下发生自聚合，无需加热及引发剂[12]，因此采用多巴胺聚合法，可以使磁性分子印迹聚合物的制备更为简单。

本文采用将磁性基底与分子印迹及SERS技术相结合的方法，制备了一种新型磁性分子印迹聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs，使其成为兼具光、磁及选择特性的复合功能材料。研究发现该聚合物应用于诺氟沙星的检测，具有优异的选择识别能力、良好的重复性及SERS性能，并可以应用于实际药品。方法对实现复杂样品中目标分子的特异性检测具有良好的应用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XploRAPLUS型激光共聚焦拉曼光谱仪(法国，Horiba公司)；JEOL JEM 2100型透射电子显微镜(日本，电子株式会社)；Hitachi S-4800型冷场发射扫描电子显微镜(日本，日立公司)；Bruker D8A A25型X射线衍射仪(德国，布鲁克公司)。

FeCl3·6H2O(分析纯，中国科密欧化学试剂有限公司)，乙二醇(分析纯，中国化学试剂工程技术研究开发中心)，氧化石墨烯(GO，中国中科时代纳米有限公司)，SnCl2·2H2O(分析纯，中国光华科技股份有限公司)，聚乙二醇(PEG4000)、NaAc，甲醛、氨水(分析纯，中国西陇化工股份有限公司)，甲醇、无水乙醇(分析纯，中国科隆化学品有限公司)，AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)(分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司)，盐酸多巴胺(DA)(分析纯，中国上海柏卡化学有限公司)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、诺氟沙星(NOFX)(分析纯，中国阿拉丁试剂有限公司)。实验用水为去离子水。

1.2 材料的制备

1.2.1 Fe3O4/GO的制备参照文献方法[13]并进行优化：将0.2 g GO超声分散于45 mL乙二醇中，将1.35 g FeCl3·6H2O、1.0 g PEG4000和2.7 g NaAc依次加入上述溶液中，50 ℃条件下搅拌4 h后，将混合物转移至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在200 ℃条件下反应8 h，然后冷却至室温，用去离子水和乙醇洗涤2～3次，真空烘干后，待用。

1.2.2 Fe3O4/GO/Ag的制备参考文献报道[14]：将0.1 g制备好的Fe3O4/GO超声分散于10 mL去离子水中，向其中加入10 mL 3%的SnCl2·2H2O溶液，反应10 min后，用去离子水和乙醇清洗2～3次并分散于一定量的去离子水中。随后，在超声条件下加入10 mL银氨溶液(25 mmol/L)，超声反应30 min后，用去离子水和乙醇清洗2～3次，得到Fe3O4/GO/Ag晶种。用磁铁收集制备好的Fe3O4/GO/Ag晶种，将其分散于200 mL含0.2% PVP的AgNO3(20 mmol/L)溶液中，在25 ℃、超声条件下加入过量的氨水(28%)和甲醛(37%)溶液，反应几秒钟后即得到Fe3O4/GO/Ag粒子，最后用磁铁分离产物并用去离子水和乙醇清洗2～3次，真空烘干后，待用。

1.2.3 Fe3O4/GO/Ag -MIPs的制备参考文献方法[15]并进行优化：称取0.02 g Fe3O4/GO/Ag粒子与0.01 g DA，超声分散于20 mL的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.5)中，搅拌均匀后向其中加入0.006 g模板分子(NOFX)，持续搅拌一定时间后，通过磁场分离产物，用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)溶液对模板分子进行洗脱，最终得到聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs。非印迹聚合物(NIPs)的制备过程除不加模板分子NOFX外，其它条件与分子印迹聚合物相同。

1.3 标准溶液的配制与拉曼光谱采集

常温下配制1.0×10-3mol/L NOFX标准溶液，并稀释至所需浓度，常温储存待用。取100 μL不同浓度的待测标准溶液与400 μL Fe3O4/GO/Ag-MIPs粒子混合，超声10～20 min后，滴加在外加磁场的石英玻璃片上，晾干后采集拉曼光谱。拉曼光谱采集参数：波长为638 nm，积分时间为10 s，积分次数为1次，功率为37.5 mW。磁性分子印迹聚合物制备过程及SERS检测示意图如图1所示。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

分别向乙二醇中加入不同质量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)的氧化石墨烯，如图2a所示，氧化石墨烯的质量控制在0.2 g时，拉曼信号最强，其用量过大时拉曼信号反而降低，因此0.2 g被认为是氧化石墨烯的最佳质量并用于进一步实验。

功能单体(DA)及模板分子(NOFX)的用量在制备分子印迹聚合物时起着至关重要的作用[16]。为了考察盐酸多巴胺和诺氟沙星的用量对MIPs的影响，保持模板分子诺氟沙星量不变，采用不同质量(0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g)的盐酸多巴胺制备出分子印迹聚合物，如图2b所示，盐酸多巴胺的质量在0.01 g时，拉曼信号最强，之后随着盐酸多巴胺质量的增加，拉曼信号反而降低，因此认为0.01 g是盐酸多巴胺的最佳质量；保持功能单体盐酸多巴胺的量不变，采用不同的质量(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g)的诺氟沙星制备出MIPs，如图2c所示，随着诺氟沙星质量的增加，拉曼信号逐渐增强，但诺氟沙星质量达到0.06 g后，拉曼信号增加程度趋于平缓。综合考虑，0.06 g被认为是诺氟沙星的最佳质量并用于进一步实验。

图2 诺氟沙星标记的分子印迹聚合物在1 420 cm-1处的SERS强度。(a)GO用量；(b)DA用量；(c)NOFX用量；(d)聚合时间；(e)模板分子(NOFX)在不同洗脱时间的拉曼光谱图Fig.2 SERS strength of norfloxacin-labeled molecularly imprinted polymers at 1 420 cm-1.(a) amount of graphene oxide(GO);(b) amount of dopamine hydrochloride(DA);(c) amount of norfloxacin(NOFX);(d) polymerization time;(e) Raman spectra of template molecule(NOFX) at different elution times

聚合时间是影响分子印迹聚合物SERS性能的重要因素，为了优化聚合反应时间，将基质材料、功能单体、模板分子分散于20 mL Tris-HCl缓冲溶液中，持续搅拌不同时间(30、60、90、120、150 min)后，采集拉曼信号。如图2d所示，随着反应时间的增加，拉曼信号逐渐增强，但当反应时间达到90 min时，拉曼信号增长趋于平缓。综合考虑，90 min被认为是最佳聚合时间并用于进一步实验。为了考察分子印迹聚合物的最佳洗脱时间，将MIPs分散于甲醇-乙酸(9∶1,V/V)溶液中对模板分子诺氟沙星进行洗脱。如图2e所示，随着洗脱时间的增加，两个特征峰的强度逐渐降低，当洗脱时间达到4 h时，拉曼光谱图可近似看做一条直线，几乎观察不到特征峰。说明模板分子已洗脱完全，因此认为4 h为最佳洗脱时间。

2.2 扫描电镜及透射电镜表征

分别对制备的Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag和Fe3O4/GO/Ag-MIPs粒子进行扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)表征，结果如图3所示。其中，图3a和3b为Fe3O4/GO的SEM及TEM表征结果，可以看出Fe3O4粒子基本呈球形，大小较为均一，且很好的附着在片状氧化石墨烯表面，这得益于石墨烯具有极大的比表面积，可以很好的吸附Fe3O4粒子；图3c和3d为Fe3O4/GO/Ag的SEM及TEM表征结果，可以看出原本光滑的Fe3O4粒子表面变得极为粗糙，且有很多小颗粒附着在表面，说明Ag粒子成功沉积到Fe3O4/GO表面；图3e和3f为Fe3O4/GO/Ag-MIPs的SEM及TEM表征结果，可以看出Fe3O4/GO/Ag表面包覆了一层厚厚的膜状物质，即为分子印迹层，说明分子印迹聚合物成功包覆在了Fe3O4/GO/Ag表面，可用于进一步实验。

图3 扫描电镜(a,c,e)和透射电镜(b,d,f)图。(a、b)Fe3O4/GO；(c、d)Fe3O4/GO/Ag；(e、f)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.3 SEM(a,c,e) and TEM(b,d,f) images.(a,b) Fe3O4/GO;(c,d) Fe3O4/GO/Ag;(e,f) Fe3O4/GO/Ag-MIPs

2.3 能谱(EDS)表征

图4分别为Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag以及Fe3O4/GO/Ag-MIPs的能谱(EDS)谱图。其中，图4a为Fe3O4/GO的EDS图，Fe、O元素来自于Fe3O4，C元素来自于石墨烯；图4b为Fe3O4/GO/Ag的EDS图，与图4a相比，图4b出现了新的谱峰，即为Ag，并且Fe、O、C元素的谱峰明显降低，表明Ag粒子成功包覆在了Fe3O4/GO表面；图4c为Fe3O4/GO/Ag-MIPs的EDS图，与图4b相比，Fe、Ag元素的峰明显降低，但C、O元素谱峰重新变高，并且出现了N元素的谱峰，证明分子印迹层成功包覆在Fe3O4/GO/Ag表面。EDS结果表明成功制备出了Fe3O4/GO/Ag-MIPs，可用于进一步实验。

图4 EDS谱图。(a)Fe3O4/GO；(b)Fe3O4/GO/Ag；(c)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.4 EDS spectra.(a) Fe3O4/GO;(b) Fe3O4/GO/Ag;(c) Fe3O4/GO/Ag-MIPs

图5 X射线衍射图。(a)Fe3O4；(b)Fe3O4/GO；(c)Fe3O4/GO/Ag；(d)Fe3O4/GO/Ag-MIPsFig.5 X-ray diffraction pattern.(a)Fe3O4；(b)Fe3O4/GO；(c)Fe3O4/GO/Ag；(d)Fe3O4/GO/Ag-MIPs

2.4 X射线衍射表征

图5分别为Fe3O4、Fe3O4/GO、Fe3O4/GO/Ag以及Fe3O4/GO/Ag-MIPs的X射线衍射(XRD)谱图。其中，曲线(a)为Fe3O4的XRD谱图，在2θ=30°、35.4°、43°、56.9°及62.5°处出现了衍射峰，分别对应于Fe3O4的(112)、(211)、(220)、(303)和(224)晶面；曲线(b)为Fe3O4/GO的XRD谱图，相较于曲线(a)而言，曲线(b)的衍射峰位置没有发生改变，但峰强度明显降低，证明在氧化石墨烯表面成功附着Fe3O4粒子；曲线(c)为Fe3O4/GO/Ag的XRD谱图，观察可得，在2θ=38.2°、44.3°、64.5°和77.5°处出现了新的衍射峰，分别对应于Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，证明Ag纳米粒子成功沉积到了样品表面；曲线(d)为Fe3O4/GO/Ag-MIPs的XRD谱图，从图中可以看出，曲线(d)的衍射峰位置没有发生改变，但峰强度有所降低，特别是Fe3O4对应的(211)晶面和Ag对应的(111)晶面峰强度降低最为明显，该结果证明聚合物成功聚合在样品表面。

2.5 表面增强拉曼光谱性能研究

为了考察磁性分子印迹聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs是否具有良好的吸附及SERS性能，实验以诺氟沙星作为模板分子对其进行拉曼光谱检测。图6a为不同浓度的诺氟沙星标准溶液的拉曼光谱图，如图所示分子印迹聚合物对不同浓度的诺氟沙星具有强的增强效应，即使达到10-8mol/L时，仍然可以观察到1 420 cm-1和1 655 cm-1处的两个主要拉曼峰；进一步研究发现，1 420 cm-1处的吸收峰强度随诺氟沙星浓度的梯度变化呈现良好的线性关系，线性方程为:y=811.14x+6715.3，相关系数R2=0.9912(图4b)，说明可以根据拉曼峰强度实现对诺氟沙星的定量分析；图6c为诺氟沙星同一浓度下，引入磁场前后的拉曼信号峰对比图，如图所示引入磁场后，拉曼信号可以达到无外加磁场时的1.5～2倍，这一结果得益于引入磁场，可以实现对样品的富集和团聚以及热点的增强；图6d为1.0×10-4mol/L的诺氟沙星在MIPs上重复吸附与洗脱(10次)的SERS图，如图所示诺氟沙星的拉曼峰强度无明显变化，相对标准偏差(RSD)为3.32%。说明磁性分子印迹聚合物具有良好的重复性，可供循环使用。

图6 拉曼光谱图。(a)不同浓度的NOFX在Fe3O4/GO/Ag-MIPs上的SERS;(b)不同浓度的NOFX在1 420 cm-1处拉曼峰强度标准曲线；(c)引入磁场与无磁场拉曼对比图；(d)10-4 mol/L NOFX在Fe3O4/GO/Ag-MIPs上的重复性SERS图；(e)Fe3O4/GO/Ag-MIPs和Fe3O4/GO/Ag-NIPs的选择识别特性Fig.6 Raman spectra.(a) SERS of different concentration of NOFX on Fe3O4/GO/Ag-MIPs and its standard curve;(b)standard raman peak strength curve of NOFX with different concentrations at 1 420 cm-1;(c) Raman spectra with magnetic field and non-magnetic field;(d) repetitive SERS spectra of 1.0×10-4 mol/L NOFX on Fe3O4/GO/AgMIPs;(e) selective recognition characteristics of Fe3O4/GO/Ag-MIPs and Fe3O4/GO/Ag-NIPs

为了考察磁性分子印迹聚合物的选择性，以氧氟沙星(OFX)、环丙沙星(CIP)、氨苄西林(AMP)、阿莫西林(AMX)和葡萄糖(Glucose)作为干扰物，进行拉曼检测，如图6e所示，与空白样品相比，除目标分子外，其他药物几乎没有产生拉曼信号，由于OFX与CIP的结构与NOFX相似，因此显示弱的拉曼信号，但模板分子NOFX显示出了很强的拉曼信号。这一结果表明，磁性分子印迹聚合物Fe3O4/GO/Ag-MIPs具有良好的选择性，为选择识别目标样品提供了良好的依据。

2.6 样品分析

为了考察磁性分子印迹聚合物的实用性，实验将所制备的磁性分子印迹聚合物用于对市售诺氟沙星胶囊的检测。将诺氟沙星胶囊除去外衣后溶解于30 mL水溶液中(含1 mL HCl)，再将该溶液稀释不同(102、103、104)倍数进行SERS检测，结果如图7所示。将检测结果带入线性方程计算可得，市售诺氟沙星胶囊中诺氟沙星的浓度为0.03 mol/L，即含量约为0.1克/粒，与说明书所示规格相符。由此证明，该磁性分子印迹聚合物可以用于实际样品的检测，磁性分子印迹聚合物具有较低的检出限，可以达到10-7mol/L。

图7 (A)不同浓度的实际样品SERS检测图；(B)不同浓度的实际样品在1 420 cm-1处的SERS信号值Fig.7 (A)SERS of actual samples with different concentrations;(B)SERS signal values at 1 420 cm-1 for actual samples with different concentrations

3 结论

本文以Fe3O4/GO/Ag为基质材料、盐酸多巴胺为功能单体、诺氟沙星为模板分子，制备出了磁性分子印迹聚合物。该聚合物具有良好的选择吸附性能、重复性及较低的检出限，可以实现对抗生素药物的快速、准确及无免疫检测。总之，实验制备的Fe3O4/GO/Ag-MIPs可以作为一种优秀的SERS基底，在食品、化学和生物等的抗生素定量检测中具有重要意义。