葛根素联合唑来膦酸对维甲酸诱导骨质疏松大鼠的治疗作用①

徐 鹏，唐华羽

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

绝经后骨质疏松症( postmenopausalosteoporosis，PMOP)，是60岁及以上女性人群的常见病，属于骨骼代谢病。由于中年女性年纪增加导致其卵巢功能衰竭，继而引发雌性激素分泌水平下降，从而打破成骨细胞以及破骨细胞之间的平衡，引发骨形成小于骨吸收。具体表现为骨量的下降与骨组织的显微结构退行性变为特征[1]。在维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型中，维甲酸可引起生殖系统的严重损伤，造成大鼠体内雌激素水平下降导致大鼠高转换型骨质疏松。即增加成骨细胞的活性与数量，相应的增加破骨细胞的活性，但对促进破骨细胞的数目与活性的作用要远大于成骨细胞，这与人类PMOP具有良好的相似性[2，3]。由于体内雌激素水平下降，引起骨质疏松的同时并对生殖系统造成了相应的损伤[4]，因此激素替代治疗成了首选，但通过传统的雌激素疗法，将会引发乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢增生等严重问题，存在相应的危险性[5]，因此使用植物性雌激素替代传统的雌激素治疗PMOP得到了专家们的重视，成为目前的研究热点之一。

因此，本研究在唑来膦酸治疗骨质疏松的基础之上使用葛根素，观察是否存在加强治疗效果的作用。为临床上治疗绝经后的骨质疏松患者，提供可供参考的治疗方案及实验数据。

1.1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选取40只健康雌性SD大鼠(SPF级，由佳木斯大学实验动物中心提供。许可证号：SCXK-(辽)2015-0001)12周龄，体重180～220g。室内饲养:温度20～25℃、相对湿度40%～70%、每日光照12h、通风良好。

1.1.2 主要试剂：维甲酸(含量99.4%)，购于北京建强伟业科技有限公司。葛根素(含量98%)及唑来膦酸，均购于北京鼎国昌盛生物技术公司。

1.1.3 主要实验仪器：Micro-CT(美国GE公司)、全自动生化分析仪(上海维镝生物科技公司)、低温离心机(中佳公司)、病理切片机(上海徕卡仪器公司)、正置光学显微镜(日本尼康)、包埋机(武汉俊杰电子公司)。

1.2 实验动物分组与给药

将40只雌性SD大鼠随机分别为空白组、模型组、唑来膦酸组、联合组，每组10只。将各组大鼠分笼饲养，自由饮水、摄食。适应性饲养1W后开始建模。造模时，除空白组外其余各组每日给予维甲酸100mg/(kg·d)进行灌胃，空白组每日给予维甲酸等量的蒸馏水进行灌胃，建模14d后，各组根据实验设计进行给药，唑来膦酸组与联合组给予7mg/kg的剂量各注射一次，其余各组给予等量的生理盐水进行注射。其中，联合组每日给与葛根素50mg/(kg·d)进行灌胃，其余各组给予等量的蒸馏水进行灌胃，连续给药10周。

1.3 组织样品采样与指标测定

1.3.1 血清样品采集：给药结束后，大鼠每只眼眶静脉采集5mL血液，离心，取上清置于冰箱冻存，已备后用。

1.3.2 骨骼组织指数测定：栓塞法处死大鼠后用手术剪从大鼠腹部正中剪开，迅速找到大鼠股骨，剔除周围肌肉韧带组织后，PBS冲洗2次，用无尘无菌纸将PBS吸干，采用Micro-CT扫描股骨远端生长板下方4mm为感兴趣区扫描，检测出股骨骨小梁的微结构(骨组织体积比、骨小梁厚度、骨小梁分离度、骨小梁数)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 股骨端骨显微参数

实验结果显示，治疗10周后的大鼠股骨远端Micro-CT扫描结果如图1所示。与空白组进行比较，模型组大鼠股骨的骨组织形态计量参数发生了显著的改变。骨体积分数 (BV/TV) 、骨小梁数量 (Tb.N) 和骨小梁厚度 (Tb.Th) 显著降低(P<0.01)，骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增加(P<0.01)，与唑来膦酸组与联合组相比均具有统计学意义(P<0.05)。联合给药组股骨BV/TV、Tb.Th及Tb.N大于唑来膦酸组(P<0.05)。骨组织形态计量学参数显示，葛根素与唑来膦酸能够恢复骨质疏松大鼠股骨骨小梁的厚度，表明葛根素对骨再生具有协同作用。

Sham组 模型组 唑来组 联合组

sham组 模型组型 唑来组 联合组

图1 各组骨微结构的改变(Pa<0.05,与sham组比较；Pb<0.05，与模型组比较；PC<0.05与唑来膦酸组比较)

图2 S-Ca与S-P的变化(Pa<0.05,与sham组比较；Pb<0.05，与模型组比较；PC<0.05与唑来膦酸组比较)

2.2 血清钙、磷水平

结果与空白组进行对比后发现，模型组S-Ca与的S-P水平显著升高(P<0.05)，经葛根素、唑来膦酸治疗后，S-Ca，S-P均降低，联合治疗组S-P低于单独给药组(P<0.05)，而S-Ca无显著意义(P>0.05)。联合治疗组血清钙、磷的含量与空白组相似，(P>0.05)见图2。上述结果表明葛根素对大鼠骨质疏松血钙、血磷具有协同作用。

2.3 各组股骨头镜下组织结构比较

空白组股骨头周围骨皮质厚而密，骨髓腔大小适中，骨皮质小梁结构粗大、致密并且排列整齐，骨髓腔中脂肪细胞数量较少，骨细胞形态正常，骨陷窝壁与骨细胞贴合紧密，没有间隙。模型组组织整体结构较其他3组异常改变，骨髓腔中可见大量脂肪细胞增生，骨小梁数目明显减少，各类原始细胞数量明显减少，明显呈骨质疏松表现；与模型组比较，唑来膦酸组组织整体结构轻度异常，骨髓腔中脂肪细胞数量较模型组有所减少，各类原始细胞数量增多。联合组股骨头周边骨皮质较厚与骨小梁均匀平排列，小梁之间间隙变小，骨细胞与骨陷窝之间没有明显的间隙。骨质疏松病理现象明显改善。见图3。

图3 各组股骨组织结构(HE染色×100 黑色箭头所示脂肪细胞，红色箭头所示骨小梁)

3 讨论

根据实验研究发现，对照组大鼠骨切片整体结构异常，骨髓腔中骨小梁的数量明显减少，大量脂肪细胞增生；各类原始细胞数量减少，并呈现骨质疏松的典型表现，说明研究模型制作成功。PMOP是一种骨质中减少有机成分，碳酸钙及磷酸钙下降，骨微结构受损，从而导致骨强度下降，骨脆性增大，易于发生骨折的骨骼性疾病，是最常见的代谢骨病之一[6]。2016年我国老年骨质疏松患病率达到36%，其中老年女性达到49%，表明代谢性骨质疏松在本国发病率明显上升[7]。在临床治疗上，对于代谢性骨病往往以孕激素、雌二醇来治疗代谢性骨质疏松，通过提高体内的雌激素水平，从而刺激成骨细胞的活性，纠正骨代谢异常[8,9]，逐步缓解生殖系统萎缩。但长期使用化学类激素，易引起心血管内壁的损伤及生殖系统癌变等严重问题，具有一定的风险性[2,10]。

本实验中，应用Micro-CT是一种对骨组织微结构数值及骨密度测量的新型技术，多用于PMOP的测定及抗骨质疏松药物的评价。本次实验探究唑来膦酸、葛根素两种药物。葛根素具有雌激素的作用，是一种异黄酮类化合物，其能有效促进成骨细胞的生成，对骨质疏松大鼠起到骨保护作用。唑来膦酸疗效确切，能够明显的抑制骨吸收的功能，能够抵抗破骨细胞所产生的降解骨无机盐的作用，药物副作用小，由于与骨矿盐结合能力强，导致药物半衰期长，临床患者治疗只需1年注射1次，这样大大地解决了患者的用药顺从性问题[11]。因此，唑来膦酸在临床上被应用广泛。本研究结果显示，唑来膦酸联合葛根素的实验模型骨结构参数及血磷，与单独应用唑来膦酸相比具有统计学意义(P<0.05)，表明葛根素可以发挥类雌激素的作用，在唑来膦酸诊治骨质疏松的基础之上，能够加强治疗效果。

综上所述，葛根素与唑来膦酸，对于维甲酸诱导的骨质疏松模型体内的骨形成具有协同作用。葛根素联合唑来膦酸可以是治疗及预防骨质疏松的有效方案，为临床用药提供实验依据。