蛇床子提取物对小鼠阴道菌群影响的研究①

孙盛梅,温达静,赵东旭,周海瑞,于春杨,郭 靖,董子钰

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

健康女性阴道存在多种微生物，与人体内分泌调节和免疫机制、阴道内酸碱度处于动态平衡状态。在正常女性阴道微生态中乳酸杆菌占据优势地位，大量研究表明，乳酸杆菌分解多种糖类产生大量细菌素及表面活性剂来抑制致病菌，通过产生乳酸及过氧化氢等物质调整阴道内环境。当阴道内感染致病菌，并迅速增殖，出现菌群失调，此时乳酸杆菌减少或不变，丧失优势地位，单一抑制细菌而不纠正阴道菌群失衡状态，治疗后阴道仍然处于易感状态，这是阴道炎症复发的主要原因。

蛇床子为伞形科植物，取成熟的果实，干燥后入药，对心血管系统，免疫系统和神经系统等都有优异的保护作用。胡玉红、张燕等[1]研究表明：蛇床子中酚类物质、单菇醇等物质对阴道菌群有抑菌作用，其有效成分主要来自蛇床子挥发油。毛樱逾等[2]研究表明蛇床子不影响乳酸杆菌的产酸能力，甚至提高乳酸杆菌的产酸能力。蛇床子有止痒作用，能有效缓解顽固性外阴瘙痒,有显著的治疗效果[3]。由于阴道微生态中多种微生物共存，乳酸杆菌与金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等微生物相互抑制、相互依存，因此，在菌群失调模型的治疗中，疗效单一的药物很难达到治疗目的。因此，本实验主要探究蛇床子提取物在拮抗阴道中致病菌：金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和大肠杆菌的作用，以及对乳酸杆菌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌种和材料

菌种：大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌，以及乳酸杆菌菌种均由佳木斯大学附属第一医院检验科微生物中心提供。蛇床子：购自佳木斯中医院药店。培养基：MRS选择性培养基，血琼脂平板、大肠杆菌显色培养基、沙氏培养基等购自环凯微生物公司。

1.2 实验对象

昆明小鼠160只，雌性、体重范围在(15±2)g，购自哈尔滨医科大学动物中心。

1.3 实验方法

1.3.1 药物提取和菌种活化

蛇床子提取物的制备：蛇床子50g，粉碎,过20目筛,用75%体积分数的乙醇溶液浸泡后进行超声提取，每次1h，间隔分为3次进行，置于4℃，调整到8000rpm，离心10min，纱布过滤,所得滤液回收乙醇,并浓缩至50mL,即得1g/mL质量浓度的药液，分装备用[4]

将四种实验菌种分别转种活化、接种到各自增菌培养基，37℃下培养24～48h，其中乳酸杆菌置于厌氧罐中培养，用灭菌环形接种环挑取培养基表面的单个菌落，导入盛有生理盐水的试管中搅拌、充分震荡，分别制成0.5麦氏浊度混悬液[5]。

1.3.2 体外探究蛇床子提取物的MIC值

取96孔细菌培养板，标记分组。A、B、C、D四排分别标记为乳酸杆菌组、大肠杆菌组、白色念珠菌组和金黄色葡萄球菌组。从左至右依次编号为：1～10号。A、B、C、D组1号孔加入小牛血清150μL，2～10号孔均加入小牛血清100μL，A、B、C、D组1号孔加入蛇床子提取物药液50μL，采用倍比稀释法将1号孔的药物2倍稀释直至第8孔，每组1～9孔定量加入对应0.5麦氏浊度的菌悬液100μL，最终1～9号孔对应的药物浓度分别为：125.00g/L，62.50g/L，31.25g/L，15.63g/L，7.81g/L，3.91g/L，1.95g/L；0.98g/L ，9号孔为阳性对照孔，10号孔为空白对照孔。恒温 37℃，培养 24～48h，置于实验台，观察以无菌生长孔所对应的蛇床子提取物质量浓度为最低抑菌浓度 (MIC值)，见表1。选取三种致病菌中最高的MIC值：7.81g/L，为第二阶段动物实验中药物的有效药物浓度。

1.3.3 蛇床子提取物对小鼠阴道菌群的影响

创建小鼠阴道菌群失调模型：随机将160只小鼠分为四组：1号乳酸杆菌组、2号大肠杆菌组、3号白色念珠菌组和4号金黄色葡萄球菌组，每组40只。实验1～4号组，每组全部小鼠阴道内均注入20μL该组对应的菌悬液，连续5d。第7天采集1～4组阴道冲洗液，稀释后分别接种到对应培养基，1号组置于厌氧袋中，37℃培养48h后菌落计数，连续检测2d。从实验第9天起，将已建成的阴道菌群失调模型1～4号组内再随机分成两组：对照组及治疗组，每组20只。对照组每日用60μL生理盐水冲洗阴道；治疗组用60μL，质量浓度为7.81g/L的蛇床子提取物药液冲洗阴道，连续10d。疗程结束后48h依照以上方法检测各组小鼠阴道内实验菌的菌落数，连续检测2d。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本实验测得蛇床子提取物对大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为3.91g/L、7.81g/L和3.91g/L。取三者最高MIC值，即质量浓度为7.81g/L的蛇床子提取物药液，进行小鼠菌群失调模型的治疗。应用蛇床子治疗前，1～4号组各组内对照组及实验组阴道菌落数对比(P>0.05)差别无统计学意义，证明各组菌群失调模型间感染严重程度无差异。1号组中实验组乳酸杆菌治疗前、后差距无统计学意义(P>0.05)，对照组治疗前、后无明显变化，差距无统计学意义(P>0.05)，见表2；2号组中实验组大肠杆菌治疗后较治疗前明显下降，差距有统计学意义(P<0.05)，对照组治疗后较治疗前无明显变化，差距无统计学意义(P>0.05)，见表3；3号组中白色念珠菌实验组治疗后较治疗前明显下降，差距有统计学意义(P<0.05)，对照组治疗前、后无明显变化，差距无统计学意义(P>0.05), 见表4；4号组中实验组金黄色葡萄球菌治疗后较治疗前相比明显降低，差距有统计学意义(P<0.05)，对照组治疗前、后相比无明显变化，差距无统计学意义(P>0.05),见表5。

表1 蛇床子提取物对4种实验菌种的影响(n=20)

表2 乳酸杆菌组中对照组和实验组给药前、 后菌落数变化

表3 大肠杆菌组中对照组和实验组给药前、 后菌落数变化

表4 白色念珠菌组中对照组和实验组给药前、 后菌落数变化

表5 金黄色葡萄球菌组中对照组和实验组给药 前、后菌落数变化

3 讨论

本实验方法简便、经济可行，明确了蛇床子提取物对小鼠阴道3种常见致病菌的抑菌活性并测得各致病菌的MIC值。为动物实验提供理论支持，选取3种致病菌的最高MIC值作为治疗菌群失调模型的最适药物浓度，起到预实验效果，避免直接动物阴道内注入不同浓度梯度的药液，出现药物浓度过高对小鼠阴道壁细胞的损伤，影响实验结论。乳酸杆菌在本实验最高药物浓度，即125g/L的药液中仍能继续生长，且相关文献表明蛇床子不影响乳酸杆菌的产酸能力甚至有增强作用。因此蛇床子提取物对乳酸杆菌的促进作用显而易见，综合冯锋, 杨建宏等[6]研究表明蛇床子提取物有止痒作用，能显著提高磷酸组织胺致痒阈，且对解脲支原体的最低抑菌浓度为 62.5～125μg/mL，与本实验所得MIC值相符。杨小进，张华菲等[7]研究表明： 乳酸杆菌对本实验3种受试菌有显著抑菌作用。提高乳酸杆菌的优势地位，分解糖原产生乳酸及抑菌物质，或通过生物夺氧方式、黏附机制和竞争排斥作用抑制致病菌的繁殖，具有良好的抑菌作用[8]。综合以上说明蛇床子对于阴道炎症的治疗具有增加乳酸杆菌数目、提高乳酸杆菌产酸及抑菌能力、抑制解脲支原体、止痒等多重功效。对提高阴道炎临床远期疗效，实现单一药物，多效、低毒、抑菌合并重建阴道微生态有临床意义。