南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞增殖和侵袭转移的影响①

杨庆伟，梁海鹏，陈小鹏，张志峰，刘延庆

(1.庆阳市人民医院肿瘤外科，甘肃 庆阳 745000；2.扬州大学医学院，江苏 扬州 225001)

南蛇藤(Celastrus orbiculatus)系卫矛科南蛇藤属植物[1～3]，在我国分布广泛，长江以南地区多见。南蛇藤含有多种药理活性成份(萜类、苷类及脂肪类化合物)，具有抗肿瘤、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗纤维化和抗生育等作用。近年来，研究发现南蛇藤总萜(主要为二萜和三萜类化合物)对消化道肿瘤表现出很好的抗肿瘤活性，对胃癌和肝癌抗瘤研究多有报道[4～6]。本研究通过南蛇藤总萜作用于人食道癌Eca-109细胞，观察其在体外对人食道癌Eca-109细胞增殖、凋亡和侵袭转移的影响，明确其抗瘤机制。

1 材料与方法

1.1 药物

南蛇藤粉碎成粉烘干，95%乙醇加热回流提取3次，旋转蒸发仪回收溶剂得到浸膏，拌入硅藻土，真空低温抽干，再用乙酸乙酯热水浴加热回流，过滤，回收得到乙酸乙酯浸膏。其主要成份为南蛇藤总萜(二萜类和三萜类)。二甲基亚砜助溶，其浓度小于0.05%，以无血清培养基配成实验所需要浓度工作液。

1.2 试剂

DMEM培养基为Gibco公司产品，小牛血清为杭州四季青公司产品，MTT粉剂为Sigma公司产品，PI(碘化丙啶)为上海晶美公司产品。鼠抗人MMP-9单抗和鼠抗人COX-2单抗为北京中杉公司产品，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠IGg为碧云天生物公司产品，人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒为博士德生物公司产品。

1.3 仪器

倒置相差显维镜为产自日本的Olympus产品，酶标仪为产自芬兰的Labsystems Dragon产品，流式细胞仪为产自美国BD公司的FACSAria产品， CO2恒温孵箱为产自美国的REVCO产品，恒温水浴锅产自于上海申生科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养：实验组分别加入浓度分别为10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤总萜，对照组用等体积的DMEM培养基替代。细胞由扬州大学医学院分子生物研究所提供，常规培养于10%小牛血清、100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中。于37℃含体积分数为5%CO2的孵箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.4.2 MTT试验： 取对数生长期人食道癌Eca-109细胞，以1×104个/孔接种于96空培养板中，培养过夜，实验组分别加入浓度分别为10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤总萜，对照组用等体积的DMEM培养基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培养24h后，加入MTT工作液(5mg/mL)20μL，继续培养4h，弃去各孔内液体，每孔加入100uL二甲基亚砜，微波振荡器振荡10min后，使细胞内和周围紫色颗粒充分溶解，室温放置10min。于全自动酶标仪测定各孔A570nm值，每组重复6复孔，计算肿瘤细胞生长抑制率(IR)=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。

选取浓度为40μg/mL的南蛇藤总萜作用于人食道癌Eca-109细胞24、48、72、96h，MTT法测定各孔A570nm值，计算细胞抑制率。对照组用等体积的DMEM培养基替代。

1.4.3 细胞凋亡率测定：人食道癌Eca-109细胞以3×105个/孔接种于六空培养板中，培养过夜，实验组分别加入浓度分别为10、20、40、80μg/mL的南蛇藤总萜，对照组用等体积的DMEM培养基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培养作用24h、48h后，离心去上清，收集细胞，转移到1.5mL的EP管中，加入10uL PI,混匀后于室温下避光10min，流式细胞仪测定凋亡率。

1.4.4 对基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白和环氧化酶-2(COX-2)蛋白表达的影响。取食道癌Eca-109细胞接种于50mL细胞瓶中，培养过夜，实验组分别加入浓度分别为5、10、20、40μg/mL的南蛇藤总萜，对照组用等体积的DMEM培养基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培养作用24h后，收集细胞，转移到1.5mL的EP管中，加入含有0.1%多聚甲醛的PBS固定，后加入含有0.1% Triton X-100的PBS,分别加入鼠抗人MMP-9单抗和鼠抗人环氧化酶-2单抗，常温下留置30min后加入羊抗鼠FTTC-IgG,静置后上流式细胞仪检测。FI(Fluresence Index ,FI)代表荧光指数，具体公式如下FI=检测管细胞平均荧光强度/对照管细胞平均荧光强度。对照管FI=1，如FI>1.为阴性表达，FI<1.为阳性表达。

1.4.5 对血管内皮生长因子(VEGF)测定。取人食道癌Eca-109细胞接种于50mL细胞瓶中，在在37℃、5% CO2的孵箱中培养作用24h后，实验组分别加入浓度分别为5、10、20、40μg/mL的南蛇藤总萜继续培养48h，对照组用等体积的DMEM培养基替代，后分别吸取培养上清留置待用。具体操作按照ELISA试剂盒要求执行。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞增殖的抑制作用

不同浓度的南蛇藤总萜作用于人食道癌Eca-109细胞24h后，MTT结果显示，南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞有抑制作用，当药物浓度为160μg∕mL时，最大抑制率为44.69%，存在量效关系，见表1。选取浓度为南蛇藤总萜40μg∕mL作用于人食道癌Eca-109细胞，分别孵育24h、48h、72h、96h后，结果显示药物作用96后，南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞最大抑制率可达40.18%，南蛇藤总萜抑瘤效果存在时间依赖性，见表2。

2.2 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞凋亡的影响

选取南蛇藤总萜10、20、40、80μg/mL各不同浓度作用于人食道癌Eca-109细胞，分别孵育24h、48h后，通过流式细胞法检测南蛇藤总萜诱导人食道癌Eca-109细胞的凋亡率。结果显示，随着南蛇藤总萜浓度的增加，人食道癌Eca-109细胞的凋亡率在逐步升高，24h作用后最大凋亡率30.64%，48h作用后最大凋亡率37.31%，南蛇藤总萜可以诱导人食道癌Eca-109细胞凋亡，呈浓度和时间依赖关系。与对照组比较，存在差异性。见表3。

表1 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞 增殖的抑制作用

表2 不同作用时间南蛇藤总萜(40μg∕mL)对人食道癌 Eca-109细胞增殖的抑制作用

表3 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞 凋亡的影响

2.3 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞MMP-9和COX-2的影响

选取浓度分别为5、10、20、40μg/mL南蛇藤总萜作用于人食道癌Eca-109细胞24h后，通过流式细胞仪法检测MMP-9和COX-2 FI值的变化。结果显示，随着药物浓度的增大，MMP-9和COX-2的FI值在逐步减小，存在量效关系，与对照组比较存在差异性。当南蛇藤总萜40μg/mL时MMP-9 的FI值(0.60±0.02)，当南蛇藤总萜40μg/mL时COX-2的FI值(0.51±0.05), 说明南蛇藤总萜能够下调MMP-9和COX-2蛋白的表达,尤其在下调COX-2蛋白的表达表现出更好的优越性。见表4。

表4 南蛇藤总萜对人食道癌MMP-9、COX-2、VEGF的影响

2.4 南蛇藤总萜对人食道癌Eca-109细胞VEGF的影响

不同浓度的南蛇藤总萜作用于人食道癌Eca-109细胞48h后，通过ELISA法检测VEGF的变化，结果显示，南蛇藤总萜能够下调VEFG的表达，存在量效关系。当南蛇藤总萜浓度为40μg/mL时，VEGF的含量降至(288.31±15.18)pg/mL，与对照组(490.62±20.73)pg/mL存在差异性。见表4。

3 讨论

全球食管癌发病率居世界恶性肿瘤第8位，在36种癌症死亡例数中排在第6位，是世界上最常见和最致命的癌症之一[7,8]。我国是食管癌高发国家[9]，发病率排在全球前5，虽然我国多年来非常重视食管癌的诊疗工作，但90%确诊的食管癌患者为中晚期，因而药物的治疗在食管癌的综合治疗中扮演着重要角色。南蛇藤总萜目前对胃癌和肝癌抑瘤报道较多，表现出很好的抗肿瘤活性。本研究结果显示南蛇藤总萜能够抑制人食道癌Eca 109细胞的增殖，诱导人食道癌Eca细胞凋亡，其抑瘤效果存在剂量和时间依赖性。COX-2是体内一种分解花生四烯酸产生前列腺素过程的限速酶，它以促进多种途径参与消化道肿瘤的发生、发展和转移，不仅在多种肿瘤细胞中表达，而且在消化道肿瘤细胞内多有高表达[10]。COX-2的高表达可改变与细胞增殖和凋亡有关的基因表达，从而促进肿瘤的形成和发生。有研究显示[11]，下调COX-2蛋白的表达，可以抑制VEGF和MMP-9的生成，抑制肿瘤的侵袭和转移。实验结果显示，南蛇藤总萜能够诱导人食道癌Eca109细胞凋亡，下调COX-2、VEGF和-MMP-9的表达，我们是否可以认为南蛇藤总萜下调COX-2蛋白的表达，导致了其下游分子VEGF和MMP-9出现低表达,同时南蛇藤总萜对VEGF和MMP-9亦有抑制作用，抑制了肿瘤的侵袭和转移。可以认为南蛇藤总萜对人食道癌Eca109细胞增殖的抑制和凋亡的影响，与南蛇藤总萜下调"COX-2-VEGF-MMP-9"信号通路密切相关。当然，肿瘤的发生是一个多因素、多基因、多步骤协同作用的复杂过程，其过程可能涉及多个癌基因和抑癌基因的突变，以及各种酶类物质的改变，其抗瘤机制还有待于进一步的研究。