丙泊酚通过上调miR-133a抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的机制研究

文放放 李熊刚 梁红涛

丙泊酚是一种用于麻醉诱导和维持的静脉麻醉药，因其起效短，恢复快而广泛应用于各种肿瘤切除手术中。多项研究表明，丙泊酚除了作为麻醉剂起作用外，还有许多非麻醉作用，如丙泊酚可抑制胰腺癌细胞生长和侵袭[1]，抑制胃癌细胞转移[2]，抑制结直肠癌细胞生长和侵袭[3]，可能对肿瘤患者预后起积极作用。乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，易复发转移，死亡率较高[4]。另有研究表明，丙泊酚具有抑制体外乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的重要作用[5]。但目前有关丙泊酚影响乳腺癌细胞生物学行为的分子作用机制尚未完全阐明。miRNA参与细胞增生、分化、凋亡等多种生理病理过程，已证实miR-133a在乳腺癌、肾癌、结直肠癌等多种肿瘤异常表达，与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为有关[6]。本研究分析丙泊酚对乳腺癌MCF-7细胞中miR-133a表达的影响，探讨其抑制乳腺癌增殖和侵袭的可能分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。

1.2 细胞培养及实验设计分组

1.2.1 细胞培养：取冻存的MCF-7细胞，室温下解冻，加入含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)中，置于37℃，5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养，培养2～3 d后进行传代。吸出培养基，加入2 ml 0.25%胰酶静置消化2～5 min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出，加入无血清DMEM培养基3 ml 反复吸打成单细胞悬液，进行传代培养。

1.2.2 实验设计分组：首先将细胞分为空白对照组(正常培养，不做任何处理)和丙泊酚(厂家：北京世桥生物制药有限公司)处理组(分别用5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L丙泊酚处理)，采用CCK-8法检测不同浓度丙泊酚对细胞增殖活性的影响，以选择合适的丙泊酚浓度进行后续实验。确定丙泊酚浓度后，将细胞分为空白对照组(正常培养，不做任何处理)，丙泊酚组(丙泊酚处理)，丙泊酚+NC inhibitor组[即丙泊酚处理，并转染阴性对照抑制剂(inhibitor)]，丙泊酚+miR-133a inhibitor组[即丙泊酚处理，并转染miR-133a特异性抑制剂(miR-133a inhibitor)]。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法检测丙泊酚对细胞增殖的影响：收集对数生长期的MCF-7细胞，用DMEM完全培养液重悬，将细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，分组分别加入0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L丙泊酚，放入37℃，5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养，分别于培养0 h、6 h、12 h、24 h、48 h时，每孔加入1∶10稀释的CCK-8试剂(北京英格恩生物科技有限公司)10 μl，继续培养2 h后。放入HBS-1096A酶标分析仪(南京德铁实验设备有限公司)中，测定细胞450 nm处吸光度(absorbancy，OD)，绘制细胞生长曲线。每组细胞设置6个重复孔。

1.3.2 qRT-PCR检测丙泊酚对细胞中miR-133a表达的影响:收集培养48 h后的对照组、丙泊酚组、丙泊酚+NC inhibitor组、丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞，使用Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，UV759型紫外分光光度计(青岛智汇谷信息技术有限公司)测定细胞总RNA在260 nm、280 nm处吸光度比值1.8～2.0，浓度100～200 μg/μl。使用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA，采用SYBR Green染料法进行qRT-PCR，检测各组细胞中miR-133a表达水平。qRT-PCR程序：95℃预变性2 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环。结果以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算细胞中miR-133a相对表达量。

1.3.3 Transwell实验检测丙泊酚对细胞侵袭能力的影响:收集培养48 h后对照组、丙泊酚组、丙泊酚+NC inhibitor组、丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞，使用无血清DMEM培养基重悬，调整细胞浓度为5×105个/ml。使用无血清DMEM培养液按1∶10的比例稀释Mateigel基底胶(美国BD公司)，然后取稀释后Mateigel基底胶100 μl加入Transwell小室并铺满上室底部，37℃放置30 min，然后在下室加入700 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养液，同时取100 μl上述细胞悬液接种于上室，37℃，5%CO2条件下培养24 h。取出Transwell小室，弃培养液，用棉签轻擦去上层细胞，在下室中加入甲醇至浸没上室，室温固定30 min后，PBS冲洗2次，加入0.1%结晶紫染色液，37℃下染色30 min，PBS冲洗。在IX53倒置显微镜(Olympus Corporation)下随机观察5个不同视野，计算透膜细胞数。每组设置6次重复。

1.3.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达:收集培养48 h后的对照组、丙泊酚组、丙泊酚+NC inhibitor组、丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞，加入RIPA裂解液(北京碧云天公司)提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并转膜至PVDF膜。加入5%脱脂奶粉中封闭1 h，加入稀释后的EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2抗体一抗(Abcam公司)，4℃反应过夜，分别加入辣根过氧化酶标记二抗，37℃孵育1 h。TBST溶液冲洗3次，每次5 min。加入超敏ECL发光液反应5 min，放入Alpha凝胶成像系统(New Discovery公司)中曝光、拍照，以β-antin为内参，使用ImageJ软件分析EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 丙泊酚作用浓度筛选 CCK-8细胞增殖实验结果，丙泊酚处理抑制MCF-7细胞增殖，表现出浓度依赖性，根据细胞增殖实验结果，选择对细胞增殖抑制率50%左右的丙泊酚浓度10 μmol/L作为最佳浓度，进行后续实验。见表1。

表1 丙泊酚作用浓度筛选

2.2 丙泊酚促进MCF-7细胞中miR-133a的表达 RT-PCR结果显示，丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组细胞中miR-133a相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，但与对照组比较均明显升高(P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞中miR-133a相对表达量高于对照组但差异无统计学意义(P<0.05)，但与丙泊酚组、丙泊酚+NC inhibitor组比较明显降低(P<0.05)。说明丙泊酚处理促进MCF-7细胞中miR-133a的表达。见表2。

表2 丙泊酚对MCF-7细胞中miR-133a表达的影响

2.3 丙泊酚上调miR-133a抑制MCF-7细胞增殖 CCK-8实验结果显示，丙泊酚组细胞增殖百分比[(50.09±4.21)%]与丙泊酚+NC inhibitor组细胞增殖百分比[(51.01±4.03)%]比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均明显低于对照组细胞增殖百分比[(98.26±8.37)%](P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞增值百分比[(91.26±7.76)%]与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但明显高于丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组(P<0.05)。说明丙泊酚抑制MCF-7细胞增殖，而抑制miR-133a表达后可逆转丙泊酚对MCF-7细胞增殖的抑制作用。见表3。

表3 丙泊酚上调miR-133a抑制MCF-7细胞增殖

2.4 丙泊酚上调miR-133a抑制MCF-7细胞侵袭能力 Transwell实验结果，丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组细胞侵袭数目比较差异无统计学意义(P>0.05)，但明显低于对照组；丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞侵袭数目与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但明显高于丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组(P<0.05)。说明丙泊酚抑制MCF-7细胞侵袭，而抑制miR-133a表达后可逆转丙泊酚对MCF-7细胞侵袭的抑制作用。见图1，表4。

表4 4组MCF-7细胞侵袭数目比较 个,

2.5 丙泊酚上调miR-133a抑制MCF-7细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达 丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，但均低于对照组(P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor组细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于丙泊酚组和丙泊酚+NC inhibitor组(P<0.05)。见图2，表5。

图2 4组MCF-7细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达

表5 4组MCF-7细胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表达

3 讨论

肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为是导致肿瘤患者死亡的重要因素[7]。探讨麻醉药物与肿瘤细胞行为的关系，不仅能够为肿瘤手术中选择合理的麻醉药物以降低围手术期风险提供依据，也可能有助于改善肿瘤患者预后。本研究结果表明，丙泊酚作用于乳腺癌MCF-7细胞，具有抑制细胞增殖和侵袭的作用，且对MCF-7细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。多项研究表明，丙泊酚具有抗肿瘤作用，但其抗肿瘤作用机制复杂，且在不同肿瘤中存在一定差异。Yang等[8]研究报道，丙泊酚通过上调miR-486表达抑制肺癌细胞生长并促进其凋亡。Yu等[9]研究表明，丙泊酚通过调控miR-24/p27信号通路失活诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡。此外，Bai等研究表明，丙泊酚可通过下调H19抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭[10]。

miR-133a是肿瘤早期诊断、预后监测的重要生物学指标[11,12]。本研究结果，丙泊酚能够上调乳腺癌MCF-7细胞中miR-133a的表达，而抑制miR-133a表达可逆转丙泊酚对MCF-7细胞增殖和侵袭的抑制作用，说明其抑制MCF-7细胞增殖和侵袭的作用机制可能与上调miR-133a表达有关。miR-133a的抗肿瘤作用与其功能多样的靶基因有关，Cui等[13]研究表明，过表达miR-133a可能通过靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)，抑制EGFR/Akt信号通路，进而抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，提示EGFR可能是miR-133a的靶向基因。EGFR具有络氨酸激酶活性，在促进细胞分裂增殖中起关键作用[14]。杜璟等[15,16]研究表明，EGFR在乳腺癌中高表达，与乳腺癌生长和侵袭转移密切相关。体外研究证实，抑制EGFR信号通路可能是临床干预治疗乳腺癌的重要靶点[17]。本研究结果，丙泊酚处理后MCF-7细胞中EGFR蛋白表达降低，而抑制miR-133a后细胞中EGFR蛋白表达升高，说明丙泊酚上调MCF-7细胞中miR-133a表达靶向抑制EGFR，可能与丙泊酚抑制MCF-7细胞增殖和侵袭有关。CD147是细胞表面高度糖基化的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白家族，能够刺激MMP-2和MMP-9产生，诱导细胞外基质降解，在肿瘤细胞侵袭中起关键作用[18,19]。本研究结果，丙泊酚组细胞中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高，而抑制miR-133a表达后细胞中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低，提示丙泊酚上调MCF-7细胞中miR-133a表达可能靶向抑制CD147、MMP-2、MMP-9表达，进而抑制细胞侵袭。

综上所述，丙泊酚对乳腺癌MCF-7细胞的增殖和侵袭具有抑制作用，且该作用呈剂量依赖性。其作用机制可能与上调miR-133a表达，进而靶向抑制EGFR和CD147-MMPs信号途径有关。本研究体外初步说明丙泊酚可通过上调miR-133a抑制MCF-7细胞增殖和侵袭，下一步可进行动物模型实验研究丙泊酚在体内对乳腺癌的抑制作用，并探讨其体内最佳作用浓度，为临床乳腺癌术中合适使用丙泊酚，减少围术期风险及术后复发转移提供参考依据。