甲醇浓度对毕赤酵母发酵表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的影响#

梁鑫 梁波 张仁怀 吕自力 艾华伟 郑飞 单旭东 陈浩然

（1. 成都中医药大学医学与生命科学学院/附属生殖妇幼医院，四川 成都 610041；2. 四川省人口和计划生育科学研究所，四川 成都 610041；3. 成都远睿生物技术有限公司，四川 成都 610000；4. 河南多美康生物药业有限公司，河南 郑州 450000）

胶原蛋白是结缔组织中最主要的结构蛋白， 对维护细胞、组织和器官的正常生理功能具有十分显著的作用[1-4]。胶原蛋白具有多种生物活性，参与细胞的迁移、分化和增殖，同时其抗原性弱，生物相容性良好，在烧创伤的治疗，创面止血、骨质疏松、眼角膜疾病等的治疗以及人造代血浆等医药卫生领域皆有广泛的用途[5-9]。因此，近年来，胶原蛋白作为人体含量最多、最丰富的天然蛋白质，在营养、保健和医药等领域的应用价值被越来越多的消费者所认可[10]。

目前已发现的胶原包括27种，其中在真皮中分布最为广泛的是I、Ⅲ型胶原[1,11]。成人皮肤中I型胶原约占80%，Ⅲ型约占20%，而胎儿和婴儿皮肤中约60%的胶原为Ⅲ型。I型胶原在体内构成有横纹的粗径原纤维，是瘢痕组织纤维化的物质基础，在愈合的伤口中大量存在，使伤口处皮肤质地坚硬而没有弹性。而Ⅲ型胶原蛋白则是皮肤中网状纤维的主要组成部分，其含量越高则纤维束越细。在创伤修复中，Ⅲ型胶原的比例高则创口皮肤细腻柔滑。Ⅲ型胶原蛋白也是婴儿皮肤无瘢痕愈合的原因之一。

以传统酸、碱、酶水解法从动物组织中提取胶原蛋白，易导致蛋白生物功效降低、临床不稳定和病毒隐患等问题。相较于传统的动物来源胶原蛋白，重组人Ⅲ型胶原蛋白具有更强的生物学活性、亲水性和可加工性，以及更低的免疫原性[12-15]。表达重组胶原蛋白的常用宿主有酵母、大肠杆菌、哺乳动物细胞、转基因烟草、昆虫细胞等[16-18]。利用基因工程技术，通过酵母分泌表达Ⅲ型胶原蛋白，具备产量高、质量稳定可控、产品无免疫排斥和过敏反应等优势[19-23]。本研究中，我们通过优化甲醇浓度对重组毕赤酵母菌株进行发酵研究，达到提高重组人Ⅲ型胶原蛋白产量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重组毕赤酵母GS115基因工程菌由本研究团队构建，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12491。

1.1.2 培养基

YPD培养基（每升）：10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖。

PTM微量元素（每升）：CuSO4·5H2O 6 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4·2H2O 0.2 g，H3BO30.02 g，CoCl20.5 g，ZnCl220 g，FeSO4·7H2O 65 g，生物素 0.2 g，H2SO45 ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌，室温保存。

分批发酵培养基 (升)：MgSO4·7H2O 14.9 g，H3PO426.7 ml，CaSO40.93g，K2SO418.2g，，KOH 4.13 g，甘油 40 g；灭菌后再加入4 ml PTM微量元素。补料生长培养基：50%（W/V）甘油（含PTM 12 ml•L-1）。

发酵诱导培养基：甲醇（含PTM 12 ml•L-1）。

1.1.3 设备

柚子。柚子营养丰富，含有糖类、有机酸、维生素A、B1、B2、C、P 和钙、磷、镁、钠等营养成分。柚子还含有生理活物质皮甙以及类胰岛素，柚肉中所含维生素C非常丰富，故柚肉能降血脂、降低血液黏滞度，减少血栓形成，有防治脑血管疾病等功效。

15 L发酵罐（上海百伦生物科技有限公司），卧式恒温振荡器（美国精骐有限公司），生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）立式压力蒸汽灭菌器（上海申宏医疗器械厂），高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），电泳仪（BIO-RAD公司），Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

一级种子：从-80℃冰箱，取出工作种子，按1:1000（V/V）接种至一级YPD培养基，28℃，摇床转速200 rpm，培养40 h左右，当OD600达到10-15左右，转接下一级种子培养基。

二级种子：按2%-5%（V/V）比例，将一级种子转入二级YPD培养基，28℃，转速200 rpm，培养24 h左右，OD600达到15-20左右，转接发酵罐。

三级发酵：二级种子按1:10比例接入10L发酵罐中发酵培养，设定pH为5.0，搅拌转速为600 rpm，温度为28℃。后期发酵采用以下两种策略。

（1）参照Invitrogen 公司方法[24]进行甲醇流加，保持溶氧在10%左右；

（2）采用两阶段发酵法，第一阶段通过补加甘油增加重组酵母菌的生物量，第二阶段，加入甲醇进行重组人Ⅲ型胶原蛋白的诱导表达。培养至溶氧上升时，以流速为250 mL•h-1开始流加50%的甘油，持续流加4 h，菌体湿重达到120-130 g•L-1停止加入甘油。待溶氧上升100%后饥饿培养0.5 h，之后开始流加甲醇，诱导重组人Ⅲ型胶原蛋白表达约72 h。加入甲醇时，维持发酵液中甲醇浓度分别在0.05%、0.1%、0.2%、0.4%，保持溶氧在10%左右。

1.2.2 分析方法

对发酵液离心上清液中重组人Ⅲ型胶原蛋白进行SDS-PAGE电泳定性检测，用分子排阻高效液相色谱（Size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析重组人Ⅲ型胶原蛋白含量。

2 结果

2.1 根据溶氧控制甲醇流加

参照Invitrogen公司提供旳巴氏毕赤酵母发酵方案[24]，微生物发酵过程中，pH、溶氧（DO）等参数反映碳源的消耗情况。当碳源消耗完，DO会上升，如果再加入碳源，由于微生物利用碳源消耗氧，使DO下降。利用这个原理可根据DO的变化控制毕赤酵母发酵过程中甲醇的流加。重组人Ⅲ型胶原蛋白表达如图1，生长曲线如图2（DO）。

图1 诱导时间电泳图

从图1电泳、图2 DO生长曲线可以看出，用原始方案发酵，虽然菌体量达到0.4 g•mL-1，但重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量只达到3 g•L-1，还达不到产业化的要求。在诱导时，补加的甘油已经消耗完，只加入甲醇补充碳源。

2.2 根据甲醇浓度控制甲醇流加

通过流加甲醇，保持甲醇浓度在0.05、0.1、0.2、0.4%（V/V）时，重组毕赤酵母菌的生长曲线见图2，重组人Ⅲ型胶原蛋白表达情况见图3。

从图2的生长曲线看出，随着甲醇浓度的增加菌体量有所提高，说明根据控制溶氧流加甲醇还不能满足菌体的生长，碳源不足导致重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量低；在甲醇浓度低的情况下，甲醇补充的碳源有利于菌的生长，甲醇浓度增大后，甲醇不利于菌的生长，当甲醇浓度达到0.4%时，菌体量开始下降，说明甲醇浓度大对菌的生长有抑制作用。

图3显示，随着甲醇浓度增加，重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量增加，但甲醇浓度增加到0.4%时，重组人Ⅲ型胶原蛋白出现大量降解，菌体量也出现下降。在甲醇浓度为0.2%时，重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量达到最大值8 g•L-1，菌体量也达到0.45 g•mL-1。说明重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达需要大量的甲醇补充碳源，但甲醇浓度不能大于0.4%。

图2 不同甲醇浓度的生长曲线

图3 不同浓度甲醇诱导重组人Ⅲ型胶原蛋白表达电泳图

3 讨论

参照Invitrogen公司提供的巴氏毕赤酵母发酵方案，在毕赤酵母诱导表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的发酵过程中，根据溶养控制流加甲醇，不能有效地监控甲醇浓度，不能有效地提供菌体生长及表达重组人Ⅲ型胶原蛋白所需要的碳源。重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量低，可能是诱导时碳源量不能满足重组人Ⅲ型胶原蛋白表达所需要的营养，需要增加优化甲醇的补加量。

利用甲醇传感器，在线检测发酵液中甲醇浓度。由于该传感器灵敏度高，响应时间短，因此能有效地控制甲醇的流加，使甲醇的浓度维持恒定。本研究结果表明，采用两阶段发酵法对重组毕赤酵母菌进行发酵，可以获得重组人Ⅲ型胶原蛋白的高效表达。第一阶段增加重组酵母菌的生物量，在培养至溶氧上升时，以流速为250 mL•h-1持续流加50%甘油4 h，菌体湿重达到120-130 g•L-1时停止加入甘油。第二阶段，加入甲醇进行诱导表达，在加入甲醇的时候控制甲醇浓度在0.2%，菌体量可达0.45 g•mL-1，重组人Ⅲ型胶原蛋白表达量达到8 g•L-1。

通过重组毕赤酵母菌两阶段发酵法，并在诱导时准确控制甲醇浓度，能更准确稳定的控制发酵过程，提高重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达量。本研究为重组人Ⅲ型胶原蛋白的产业化奠定了基础。