NAC饲喂努比亚山羊对ADCY8、PIK3R2基因在性腺轴组织表达水平研究

洪 磊，骆金红，敖 叶，唐 文，韦仕南，陈 祥*

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

努比亚山羊体格高大、产肉率高、生长速度快等特点，是我国目前生长速度最快和体格最大的山羊品种，成年公羊一般体重可达100 kg以上，成年母羊可达70 kg以上[1]。提高努比亚山羊的繁殖性能将有助于提高生产效益。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是天然氨基酸L-半胱氨酸与还原性谷胱甘肽(GSH)的前体物质，化学名称为2-氨基-3-巯基丙酸[2]。GSH具有强抗氧化作用，可以提高卵母细胞的质量[3]。NAC在肝脏、肌肉、肾脏和肺脏中含量较丰富[4]，对肝脏保护、生殖免疫、细胞凋亡调节、抑制炎性等方面均有一定的作用[5-7]。侯永清等[8]研究发现在饲粮中添加NAC对仔猪生长性能有促进作用，NAC也可以通过降低血清雄激素和游离睾酮水平，最终辅助诱导多囊卵巢综合征患者排卵提高生殖率[2]。

腺苷酸环化酶8(Adenylate Cyclase 8,ADCY8)是一种蛋白质编码基因[9]，其相关通路包括卵巢类固醇生成和G蛋白信号通路。ADCY8基因与卵母细胞减数分裂、孕激素介导的卵母细胞成熟等有关[10]。ADCY8也在参与控制能量平衡和营养的下丘脑中表达[11]。磷脂酰肌醇-3-激酶调控亚基2(Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 2，PIK3R2)是PI3K p85亚基家族的一员，它降低了PI3K/AKT通路的生理激活，该通路调节细胞增殖、存活、侵袭、转移和血管生成[12]。PIK3R2基因参与调节胰岛素分泌[13]、抵抗细胞凋亡[14]、调控磷酸化等过程。目前NAC及ADCY8、PIK3R2基因研究主要集中在牛[15]、猪[16]、大鼠[17]上，在羊上的研究较少。课题组前期研究发现，妊娠早期(配种后0～30 d)饲喂0.07%NAC的努比亚山羊产羔率最高，因此本试验通过探究ADCY8、PIK3R2基因在妊娠早期(配种后0～30 d)饲喂0.07% NAC的努比亚山羊性腺轴组织中表达量变化，旨在从基因水平来探讨NAC对努比亚山羊繁殖性能的影响，为NAC对山羊繁殖相关基因的调控作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物来自贵州省册亨海铭巍生态畜牧业开发有限公司种羊场，选择3～4岁产羔2～3胎次的努比亚山羊母羊30只，对照组、试验组各15只，配种后的第二天于试验组饲粮中添加0.07%的NAC，饲喂当天记为0 d，持续饲喂30 d后分别采取对照组、试验组努比亚山羊下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

NAC(珠海市泛海生物技术有限公司，纯度≥97%)；Trizol试剂(贵州绿盟英创生物科技有限公司)；液氮、氯仿、0.5%TAE缓冲液、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖，所用试剂均为市购；荧光 primer、逆转录试剂盒均购自擎科生物科技有限公司。

1.3 试验仪器

PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、实时荧光定量PCR仪(型号为CFX96 Real-Time System)、凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ)，均购自美国BIO-RAD有限公司；紫外可见分光光度计，购自美国Thermo Fisher有限公司；电泳仪(DYY-2C型)，购自北京市六一仪器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 RNA提取和cDNA的合成 利用TRIzol试剂盒提取努比亚山羊的下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织的RNA。将各个组织RNA稀释成同等浓度后，利用反转录试剂盒合成cDNA第一链。将提取后的RNA按20 μL体系进行反转录为cDNA，体系为：dNTP Mix 4 μL、RT Buffer 4 μL、primer Mix 2 μL、RNA模板2 μL、DTT 2 μL、HiFiscript 1 μL和RNase-Free Water 5 μL加入PCR小管，振荡混匀，离心后，于PCR仪上42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min；反应结束后，取1 μL反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，-20 ℃保存备用。

1.4.2 引物设计 根据GenBank上传的ADCY8基因、PIK3R2基因序列，设计ADCY8、PIK3R2基因引物(Primier 6.0软件)，以β-actin为内参基因，送至上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.3 实时荧光定量PCR条件优化及反应 在其他条件相同的情况下，对退火温度和引物浓度进行摸索、优化，筛选最佳退火温度和引物浓度，确定最佳反应体系及退火温度，用于下一步的实时荧光定量PCR试验。检测ADCY8、PIK3R2基因在努比亚山羊下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织中的表达量。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL；上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)；cDNA 1 μL (1 500 ng/μL)；ddH2O 7 μL。程序如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性10 s；65 ℃退火5 s；72 ℃延伸15 s；进行40个循环，95 ℃，15 s；最后从60 ℃按0.5 ℃增值到95 ℃进行溶解曲线分析，荧光采集时间为5 s，每个样品进行3个平行试验。

1.4.4 数据处理及分析方法 试验数据应用2-△△Ct法分析ADCY8、PIK3R2基因在5个组织中的差异表达量，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，使用LSD法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 ADCY8、PIK3R2基因的PCR扩增

以反转录产物cDNA为模板对ADCY8、PIK3R2基因进行PCR扩增，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果由图1可见，目的产物条带明亮、无拖尾，与目的片段大小(ADCY8 139 bp、PIK3R2 146 bp)一致，可进行下一步试验。

2.2 q-PCR的扩增曲线和溶解曲线

由图2、图3可知：实时荧光定量PCR试验后得到的荧光扩增曲线和荧光溶解曲线，ADCY8(图2)、PIK3R2(图3)在5个组织中扩增曲线呈现光滑完整的“S”形状，曲线平滑无特殊趋势。循环阈值全部处于扩增曲线的对数期，溶解曲线全部呈单峰，峰值较好，无杂峰，无引物二聚体，达到试验要求。

2.3 ADCY8、PIK3R2基因在不同组织中的表达

由图4、图5可知：ADCY8、PIK3R2基因在对照组和试验组努比亚羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个组织中均有不同程度的表达。ADCY8在垂体和下丘脑表达中，对照组极显著高于试验组(P<0.01)，在子宫中试验组极显著高于对照组(P<0.01)，在卵巢中均呈现低度表达；PIK3R2在垂体和下丘脑中，对照组极显著高于试验组(P<0.01)，卵巢、输卵管、子宫差异不显著。由图4可知：ADCY8在对照组表达中，下丘脑极显著高于其他组织(P<0.01)；在试验组表达中，子宫极显著高于其它组织(P<0.01)，垂体和下丘脑极显著高于卵巢和输卵管(P<0.01)。由图5可知：PIK3R2基因在对照组表达中，垂体极显著高于其他组织(P<0.01)，下丘脑极显著高于卵巢、输卵管、子宫(P<0.01)，子宫极显著高于卵巢和输卵管(P<0.01)；在试验组表达中，子宫和垂体极显著高于卵巢、输卵管、下丘脑(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 NAC对努比亚山羊ADCY8基因表达影响

NAC有多方面的生物学功能，在医学上研究非常广泛，近年来也受到广大畜牧行业者的关注。NAC可在体内转化为能够刺激谷胱甘肽(GSH)合成、促进解毒、直接清除自由基的代谢物，且NAC可以提高红细胞、肝组织和肺组织中细胞内的谷胱甘肽含量[18]，保护肝脏和肾脏免受氧化应激损伤。张伟等[19]研究表明饲粮中添加0.05%NAC能有效缓解脂多糖(LPS)刺激引起的负面影响，提高肠黏膜的抗氧化能力。ADCY8基因在卵巢、睾丸、肾上腺等组织均有一定水平表达[20]，本研究发现卵巢在对照组和0.07%NAC组中均有表达，与前人检测结果相同。Raoux等[13]敲除了下丘脑中的ADCY8，以评估ADCY8在葡萄糖稳态中枢调控中的必要性，最后证实ADCY8在人胰岛中表达。Liu等[21]研究发现ADCY8参与雌激素信号通路，它受雌激素受体和雌激素的正向调节而雌激素能够有效刺激乳腺细胞生长发育[22]。因此，提高ADCY8基因的表达将有助于山羊生产性能的提高。本研究发现ADCY8在下丘脑表达中，对照组极显著高于0.07%NAC组，说明NAC饲喂后ADCY8在下丘脑的表达量下调，因此可能会影响动物泌乳。而子宫内膜接受能力是哺乳动物胚胎植入成功的关键，Zhang等[23]研究推测ADCY8可能在子宫内膜接受能力的发育中发挥重要作用，可以提高子宫内膜的接受能力，促进胎儿着床。本研究发现该基因在子宫和输卵管中的表达量上调，提示NAC可能直接作用于子宫和输卵管对繁殖方面产生影响，其作用机理还有待进一步研究。

3.2 NAC对努比亚山羊PIK3R2基因表达影响

本试验结果表明添加NAC使得山羊5个组织PIK3R2基因表达均降低，在下丘脑中，对照组极显著高于0.07%NAC组。目前，对PIK3R2的研究主要是基于其对各种细胞信号通路的影响，但是目前在山羊繁殖相关影响上研究较少。Hu等[24]研究表明，miR-126通过下调PIK3R2的表达来促进老鼠血管生成，抑制炎症，并对挫伤后的恢复产生积极影响。在Salajegheh等[25]研究中，PIK3家族中PIK3R2及其亚型的突变与抗癌药物耐药性的发生有关，PIK3R2在血管生成通路中起负调节作用。本研究中饲喂NAC后PIK3R2基因在5个组织中表达量均下调，说明饲喂NAC可能通过维持子宫内环境的健康、促进妊娠期血管的生成来保证胎盘、胚胎的良好发育。Cheung等[26]研究发现PIK3R2是与癌症相关的基因。杨文芝[27]研究表明，miR-126靶向PIK3R2通过调节PI3K/AKT信号通路有助于成纤维细胞的增殖并抑制其凋亡，因此抑制miR-126可能改善成纤维细胞增殖与调亡之间的失衡。Du等[28]研究证明miR-126-3p下调通过靶向PIK3R2促进肝癌转移和血管生成。因此降低PIK3R2基因的表达将可能有助于妊娠动物细胞代谢与增殖，调节细胞生长平衡来维持母体与胎儿健康。本研究发现PIK3R2在努比亚山羊性腺轴组织中均有表达，但饲喂NAC下调了PIK3R2在山羊5个组织的表达，推测该基因可能有助于提高山羊繁殖性能，为进一步研究PIK3R2对繁殖影响提供参考。

4 结 论

ADCY8、PIK3R2基因在努比亚山羊性腺组织中均有不同程度的表达，NAC的添加使得ADCY8、PIK3R2基因在5个组织表达产生变化，ADCY8基因在对照组下丘脑和垂体的表达量高于0.07% NAC组，而0.07% NAC组子宫的表达量高于对照组；PIK3R2基因在对照组垂体和下丘脑表达量高于0.07% NAC组。说明NAC的添加使ADCY8在垂体和下丘脑中表达量下调，子宫表达量上调，PIK3R2表达量均下调，此结果可为NAC对山羊繁殖相关基因表达影响研究提供参考。