西安某医院临床分离嗜麦芽窄食单胞菌的临床分布及毒力基因检测*

井发红，辛 娜，何天娇，李 卓

西安医学院第一附属医院检验科，陕西西安 710077

嗜麦芽窄食单胞菌是一种革兰阴性非发酵菌，在自然界广泛分布，亦可寄居于人的呼吸道和肠道中，该菌并非强毒力细菌。但是，目前它所造成的医院内感染正在不断增加。中国耐药监测网的数据显示，在非发酵菌中嗜麦芽窄食单胞菌分离率位列第3位[1]。目前发现，嗜麦芽窄食单胞菌主要感染恶性肿瘤[2]、进行了介入性治疗[3]、有慢性呼吸道疾病、免疫缺陷、抗菌药物用药史[4]、长期在重症监护室进行治疗[5]的患者。而且嗜麦芽窄食单胞菌对大多数临床常用的抗菌药物天然耐药，如氨基糖苷类和很多β-内酰胺类(如碳青霉烯类)抗菌药物，导致临床感染难以控制[6]。本研究对临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌的耐药情况、生物膜形成能力和毒力基因等进行检测，结合患者临床信息进行分析，旨在了解嗜麦芽窄食单胞菌的耐药机制和感染特点，以指导临床的合理用药和控制医院内感染。现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2017年1月至2018年12月西安医学院第一附属医院检验科微生物室分离的嗜麦芽窄食单胞菌菌株79株，均来自住院成人患者，剔除重复菌株，所有菌株均经过VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏仪进行鉴定，同时收集患者的临床信息及抗菌药物的使用情况。

1.2抗菌药物及培养基 抗菌药物包括左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲唑和米诺环素，药敏纸片均购自英国Oxoid公司，血琼脂平板和水解酪蛋白琼脂平板购自郑州安图公司，质控菌株为铜绿假单胞ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922，药敏结果的判定参照美国临床与实验室标准化协会(CLSI)2016年的标准。

1.3仪器与试剂 PCR扩增仪购自新加坡公司；VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定药敏仪购自法国生物梅里埃公司；PCR试剂盒和细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DNA Marker购自日本TaKaRa公司。

1.4生物膜测定 挑取过夜培养的嗜麦芽窄食单胞菌单个菌落用新鲜配制的TSB配制到D600=1(相当于1×109cfu/mL)，再用肉汤按1∶100稀释到D600=0.01(1×107cfu/mL)，分别吸取200 μL菌液加入到96孔微孔板中，37 ℃静置培养24 h。采用结晶紫实验检测嗜麦芽窄食单胞菌生物膜形成能力[7]。首先将培养的平皿60 ℃固定1 h；然后弃去上清液，再用灭菌生理盐水清洗4次；每孔加入50 μL 0.5 mg/mL结晶紫染液，室温静置5 min；用自来水洗去残余染料，自然晾干；加入250 μL 33%冰醋酸溶解15 min；用酶标仪测定波长492 nm处的吸光度(A)值来评估生物膜的形成能力。

1.5毒力基因的检测 采用PCR方法检测嗜麦芽窄食单胞菌的4个主要毒力基因(Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus)，所得产物采用琼脂糖凝胶电泳，电压5 V/cm，10 min，根据片段大小判断有无，并计算毒力基因的携带率。合成引物参考文献[8]，见表1。

表1 毒力基因引物序列表

2 结 果

2.1嗜麦芽窄食单胞菌的来源及临床分布特点 79株嗜麦芽窄食单胞菌主要来自于呼吸及重症医学科(29例)，神经外科(28例)，以及全科医学科、内分泌科、肾病血液科和骨科等。嗜麦芽窄食单胞菌感染患者中，男51例(占64.6%)，女28例(占35.4%)。<40岁2例(占2.5%)，40～<50岁3例(占3.8%)，50～<60岁4例(占5.1%)，60～<70岁9例(占11.4%)，70～<80岁11例(占13.9%)，80～<90岁26例(占32.9%)，>90岁24例(占30.4%)。菌株主要来自痰标本62例，肺泡灌洗液6例，分泌物8例，尿液3例。79株菌株对左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的耐药率分别为12.6%和3.8%，未检出对米诺环素耐药的菌株。患者在分离到嗜麦芽窄食单胞菌前均应用过2～5种抗菌药物，其中使用3种以上的患者占64.5%，主要的抗菌药物为头孢菌素类(82.3%)、碳青霉烯类(53.1%)和含酶抑制剂复合制剂(63.3%)。

2.2生物膜形成能力 嗜麦芽窄食单胞菌的生物膜形成能力A492为0.50±0.42，女性患者生物膜形成能力A492为0.54±0.41，男性患者A492为0.48±0.44，男、女性患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3毒力基因检测 毒力基因检测显示，Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus的阳性率较高，分别为75.9%、91.1%、93.7%和44.3%。

3 讨 论

嗜麦芽窄食单胞菌是一种常见的医院内机会性致病菌，随着广谱抗菌药物的大量使用和免疫抑制剂的广泛应用，且侵入性操作不断增多，该菌的分离率逐年上升，给临床治疗带来极大困难。本研究结果显示，79株嗜麦芽窄食单胞菌主要来源于呼吸及重症医学科，其次是神经外科。该类科室的患者基础疾病较为复杂，自身免疫力低，同时应用多种广谱抗菌药物治疗，导致菌群失调，并且该类科室患者住院周期长，多需接受机械通气及深静脉置管等创伤性操作，这些均是引起嗜麦芽窄食单胞菌医院内感染的易感因素[9]。

本研究结果显示，菌株来自痰标本62例。引起患者呼吸道感染的原因主要是由于嗜麦芽窄食单胞菌易定植于呼吸道及胃肠道，同时患者在分离到嗜麦芽窄食单胞菌前均应用过2～5种抗菌药物，且使用3种及以上抗菌药物的患者占64.5%。广谱抗菌药物的大量使用使患者体内正常菌群遭到破坏，而有利于嗜麦芽窄食单胞菌的生长。同时发现该菌感染以男性居多，>60岁患者占88.6%，说明嗜麦芽窄食单胞菌感染好发于老年人等免疫力低下患者。另一方面随着年龄增长，气管功能逐渐衰退，肺泡弹性及支气管纤毛上皮运动逐渐减弱，使呼吸道清除功能减弱[10]。

本研究药敏结果显示，79株菌株对左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的耐药率分别为12.6%和3.8%，所有菌株均对米诺环素敏感，低于国内其他地区的报道[11],与刘加军等[12]报道的结果相似。甲氧苄啶-磺胺甲噁唑是目前治疗嗜麦芽窄食单胞菌的首选药物，但是本院目前已出现对其耐药的菌株，应引起重视。国内外已有研究表明，体外联合用药优于单一用药[13-14]。因此，临床上针对嗜麦芽窄食单胞菌感染严重的患者可以考虑甲氧苄啶-磺胺甲噁唑联合其他药物的治疗方案。

革兰阴性杆菌重要的特点是易形成生物膜，侵入性操作的增加使生物膜相关感染和病死率不断增加，本研究中嗜麦芽窄食单胞菌的生物膜形成能力A492为0.50±0.42；毒力基因检测显示，Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus的阳性率较高。

总之，本院嗜麦芽窄食单胞菌感染主要分布于呼吸及重症医学科、神经外科，患者以男性居多，大多使用过3种及以上抗菌药物，毒力基因携带率高，由于该菌对多种抗菌药物耐药，要求医生在临床工作中注重病原学的检验，针对病原菌合理选择抗菌药物，减少嗜麦芽窄食单胞菌的感染及耐药菌株的产生。