三阴性乳腺癌患者PD-1/PD-L1通路表达改变及临床意义

苗天培，张震宇，李 中

（1.河北大学医学院，保定 071000；2.河北大学附属医院乳腺外科，保定 071000）

三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和Her2/neu受体均为阴性的乳腺癌，在所有乳腺癌患者中约占15%［1-2］。与普通乳腺癌相比，TNBC具有发病年龄相对较轻、肿瘤恶性程度较高以及发生复发和转移的可能性更大等特点，对全球妇女健康产生重大影响［3］。免疫靶向治疗是近年来受到广泛关注的癌症治疗方式，与放化疗相比，免疫治疗可针对肿瘤发生免疫逃逸的通路进行靶向抑制，以此来抑制肿瘤生长，取得了良好的效果，美国FDA已批准将T细胞的共抑制分子程序性死亡受体/配体-1（Programmed death receptor/ ligand-1，PD-1/PD-L1）抗体药物Pembrolizumab和Nivolumab用于几类恶性肿瘤的治疗［4-5］。因此，有必要对PD-1/PD-L1在TNBC患者中的表达改变及其临床意义进行研究，本研究就此展开讨论，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取河北大学附属医院乳腺外科2016年1月～2019年10月收治的三阴乳腺癌患者50例作为研究对象，患者年龄36～73岁，平均56.02±9.30岁，纳入研究组，选择同期于我院进行治疗的非三阴性乳腺癌患者55例作为对照，患者年龄27～83岁，平均年龄53.04±11.06岁，纳入对照组，两组患者在年龄、病理类型、组织学分级方面差异无统计学意义。纳入标准：①乳腺癌及三阴性乳腺癌的诊断参照中国癌症协会发布的《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2019版）》，患者均经病理组织学确诊。②入院前未经放化疗治疗。③临床资料完整。④患者对本研究知情同意。排除标准：①患者合并乙肝、艾滋病等严重传染性疾病者。②合并除乳腺癌外导致患者免疫功能严重不全疾病者。③患者肝肾功能不全，对放化疗无法耐受者。

1.2 PD-1/PD-L1在外周血及病灶组织的mRNA表达所有入选患者入院后次日清晨抽取其外周静脉血2mL，采用淋巴细胞分离液按照步骤制备为外周血单个核淋巴细胞液。对医院保存患者乳腺癌病灶组织标本进行收集，将血液标本与组织标本均采用密度梯度离心法提取其RNA，并逆转录为cDNA，试剂盒购自北京TIANGEN生化科技有限公司。采用荧光定量聚合酶链式扩增法（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain amplification，RT-PCR法）检测癌组织及外周血中PD-1/PD-L1水平，所用引物序列为：PD-1：上游：5’－CGGCCAGTTCCAAACCCT－3’，下 游：5’－CCATTCCGCTAGGAAAGACA－3’。PD-L1：上游 5’-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3’，下游 5’-TGCAGC CAGGTCTAATTGTTTT-3’，所选内参基因为GAPDH，引物序列：上游5’-GTACGACTCACTATAGGGA -3’，下游5’-AACAGCGACACCCACTCCTCCA-3’，引物设计采用Prime 5.0软件，由南京擎科生物科技有限公司合成，相对表达结果计算采用2-∆ct法计算得出。

1.3 统计学分析收集的实验数据使用SPSS 17.0进行分析，实验数据中符合正态分布的计量资料采用mean±SD表示，两组比较采用独立样本t检验，同组比较以配对t进行，计数资料以例数或率表示，两组比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性分析法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者PD-1、PD-L1水平比较与对照组相比，研究组患者癌组织及外周血中PD-1、PD-L1水平均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两组患者PD-1/PD-L1水平比较

2.2 转移及未转移组患者PD-1、PD-L1水平比较共有12例三阴乳腺癌患者发生肿瘤的局部转移，与未转移组相比，转移组三阴乳腺癌组患者癌组织及外周血中PD-1、PD-L1水平均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 转移及未转移组患者PD-1、PD-L1水平比较

2.3 化疗前后患者PD-1、PD-L1水平比较与治疗前相比，经过放化疗治疗后，患者PD-1、PD-L1水平明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 化疗前后患者PD-1、PD-L1水平比较

2.4 PD-1、PD-L1水平相关性分析相关性分析结果表明，癌组织与外周血中PD-1/PD-L1水平均呈正相关关系，癌组织与外周血中PD-1、PD-L1水平与CD4+T淋巴细胞水平均呈负相关关系，均具有统计学意义，见表4。

表4 PD-1、PD-L1水平相关性分析

3 讨论

乳腺癌是当今时代对女性健康危害较为严重的恶性疾病，发病率较高，近年来随着医学技术的进步，该病的早期诊断及治疗有了长足的进步，但对于晚期患者来说，对身体伤害极大的放化疗仍是患者进行治疗的主要手段。美国国家综合癌症网络中心（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）对12000名乳腺癌患者调查结果表明，与非TNBC患者相比，TNBC患者在发现疾病后2年内乳腺癌特异性生存率、总体生存率更低［7］，寻找特异性高的分子用于TNBC的治疗评价及预后预测具有重要价值。PD-1是近年来免疫学界受到广泛关注的明星分子，属于B7H4蛋白超家族，现已发现的配体包括 PD-L1 及 PD-L2［8］。既往研究［9］表明，以PD-1、CTLA-4、CD28、Tim-3、TIGIT、LAG3等为代表的共信号分子可对T细胞功能产生抑制，是肿瘤逃逸的关键机制之一，而以PD-1抗体为主的免疫靶向肿瘤治疗药物已在临床中有所应用［10］，然而，PD-1/PD-L1在TNBC的治疗及预后方面的作用仍不明确。

目前PD-1的检测主要有几种方式，通过免疫组化检测其组织中的蛋白表达、通过流式细胞术检测其在T细胞表面的表达、通过ELISA法检测其蛋白在外周血中的表达以及通过RT-PCR检测其在外周血或病灶组织出的mRNA水平，与其他方法相比，RT-PCR法具有检测灵敏、成本相对较低等优势［11-12］。本研究通过对外周血及病灶组织处PD-1/PD-L1 mRNA水平进行检测，结果表明，与非TNBC相比，TNBC组PD-1/PD-L1明显上调，而与非转移TNBC患者相比，发生转移的TNBC患者PD-1/PD-L1水平更高，同时，放化疗治疗可明显降低TNBC患者PD-1/PD-L1水平。此前研究［13］表明，高PD-1阳性免疫细胞浸润与患者TNBC生存期缩短有关，而PD-1+细胞与TNBC患者高组织学分级、肿瘤分期存在联系。RNA测序结果［14］也显示，与非TNBC相比，TNBC患者PD-L1表达显著增加。在国内学者的研究中，张亚等［15］发现 PD-1 和 PD-L1 在乳腺癌组织中呈高表达，与肿瘤的侵袭转移及不良预后存在紧密联系，骆丽等［16］研究表明 PD-L1及PD -1在TNBC中高表达，可以作为TNBC免疫治疗的靶标及预后标记物，而肿瘤体积大、BLBC、Ki67 增殖指数高及高 TIL是PD-L1及PD-1 表达的危险因素，此外PD-1/PD-L1表达在 TNBC中存在组织学异质性。

本研究结果证明了三阴乳腺癌患者比普通乳腺癌患者癌组织及外周血中发生了明显的PD-1/PD-1通路上调，且与肿瘤转移、放化疗治疗存在联系，因此对于临床治疗效果的判别具有一定价值，但本研究依然存在一定的缺陷，例如病例数较少、未对其预后价值进行分析等，其机制有待深入研究。