川芎嗪对PGBE1干细胞样细胞原癌基因表达的作用

吴茂森，陈庆贤，刘丽霞

（海南西部中心医院药学部，儋州 571700）

近年来，肿瘤已经成为威胁人类生存健康的重要疾病，其中肺癌的发病率不断上升。恶性肿瘤患者的生存率低，在很大程度上与干细胞样细胞的存在有关。肿瘤干细胞具有自我更新、增殖、分化的能力，参与肿瘤的生长和转移，与肿瘤的侵袭转移密切相关［1］，肿瘤干细胞是目前广大专家学者广泛关注的问题之一。肿瘤的发展受癌基因、抑癌基因、生长因子的影响。血瘀证是恶性肿瘤临床患者中医症状，主要治疗手段是活血化瘀，川芎嗪是中药活血药中川芎的主要有效成分。本实验主要是研究分析了川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞原癌基因表达的抑制作用。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂细胞株：高转移性人巨细胞肺癌细胞PG-BE1，购自上海酶研生物科技有限公司上海酶研生物科技有限公司。主要试剂：盐酸川芎嗪（常州制药厂）；双抗（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；人碱性成纤维细胞生长因子（FGF）（上海酶联免疫生物有限公司）；重组人表皮生长因子（EGF）［（赛默飞飞世尔（上海）］；胰岛素（美国 Sigma公司）；B27添加剂（美国Gibco公司）；RPMI-1640 培养基（上海浩然生物科技有限公司）；DMEM/F12培养基（Sigma-Aldrich 公司）；VEGE ELISA试剂盒（美国R&D公司）；β-Actin Rabbit mAb（美国CST公司）；Anti-BCRP/ABCG2抗体（美国Abcam公司）；Anti-HIF-1-α抗体（美国Abcam公司）；Goat Anti-Rabbit IgG H＆ L（HRP）、GoatF（ab’）2 ployclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgAH&L（HRP）（均购自美国Abcam公司）；主要仪器：CO2培养箱（上海京孚公司）；光学显微镜（上海光学仪器一厂）；PCR仪（美国ABI公司）；低温高速离心机（美国Thermo公司）；-80℃冰箱（海尔）；酶标仪（美国Bio Tek公司）；微量移液器等。

1.2 PG-BE1干细胞样细胞分选采用无血清成球培养法分选PG-BE1干细胞样细胞：常规复苏PG-BE1细胞后在培养基内培养。对细胞进行传代培养，在达到指数生长期的时候，胰酶消化、冲洗、重新置于培养基中，调整其浓度为2×104个/mL，接种2mL/孔于六孔板中。待细胞成球、表面颜色变暗、折光度变低时收集细胞。

1.3 检测PG-BE1干细胞样细胞与亲代细胞的克隆形成能力采用平板克隆形成实验检测PG-BE1干细胞样细胞与亲代细胞的克隆形成能力：收集两种细胞，消化后置于培养基中，调整其浓度为200个/mL，分别接种2mL/孔于六孔板中。培养6天后弃去培养液，用95%乙醇固定并结晶紫染色，于显微镜下观察。每孔随机选择5个视野下超过10个细胞的克隆灶数目。

1.4 检测PG-BE1干细胞样细胞与亲代细胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达Western blot法检测PG-BE1干细胞样细胞与亲代细胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达：收集两种细胞后，提取各组细胞总蛋白并测定其总蛋白浓度。制备浓缩胶与分离胶、加样、电泳、膜转移、脱脂奶粉封闭、一抗与二抗孵育、暗室中发光、数据分析。以原代细胞光密度值作为参照，采用相对光密度值（RQ）表示。

1.5 分组与药物干预将PG-BE1干细胞样细胞培养48h，之后随机分为空白对照组、低、中、高剂量川芎嗪组（分别为100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL），在无血清培养液中培养24小时，之后收集各组细胞。

1.6 各组PG-BE1干细胞样细胞的VEGF表达ELISA法检测各组PG-BE1干细胞样细胞的VEGF表达：将各组细胞的上清液收集后，严格按照ELISA试剂盒步骤操作。

1.7 各组PG-BE1干细胞样细胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表达Westen blot法检测各组PG-BE1干细胞样细胞的HIF-1α和ABCG2蛋白表达：收集各组细胞，按照1.4.3的步骤操作，检测HIF-1α和ABCG2蛋白的表达。

1.8 VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表达RT-PCR检测VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表达：收集各组细胞，提取细胞总RNA，置于PCR仪中进行逆转录操作，按照荧光定量PCR反应程序进行扩增，反应结束后，使用SDS软件对数据进行分析。

1.9 统计学分析实验所得数据采用均数±标准差表示。用SPSS 19.0进行统计处理，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，多组内两组间比较采用 LSD检验。以P<0.05判定差异有显著性。

2 结果

2.1 PG-BE1干细胞样细胞分选接种后第3天开始可以看见有细胞球形成，之后球体逐渐越来越大，到第6天时，细胞球表面颜色变暗、球体折光度变低，结果见图1。

图1 PG-BE1干细胞样细胞形成的细胞形态（×200）

2.2 PG-BE1干细胞样细胞克隆形成能力PG-BE1原代细胞与干细胞样细胞的平板克隆灶形成数目分别为（8.47±1.48）个、（4.25±1.09）个，两组相比较，PGBE1干细胞样细胞克隆灶形成能力更强，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 PG-BE1干细胞样细胞与亲代细胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达以原代细胞光密度值作为参照（设为1.00），并与其相比较，PG-BE1干细胞样细胞表面OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表达均强于原代细胞（P<0.05，表1、图2）。

表1 PG-BE1原代细胞与干细胞样细胞表面相关标记蛋白的表达

图2 Westen blot检测SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表达的结果

2.4 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞VEGF表达的影响低、中、高浓度的川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的VEGF表达均有抑制作用（P<0.05），各药物组间比较差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

表2 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞VEGF表达的影响（ng/mL）

2.5 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞HIF-1α和ABCG2表达的影响低、中、高浓度的川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的HIF-1α和ABCG2表达均有抑制作用（P<0.05），各药物组间比较差异无统计学意义（P>0.05，表3、图3）。

2.6 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表达的影响低、中、高浓度的川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表达均有抑制作用（P<0.05），各药物组间比较差异无统计学意义（P>0.05，表4）。

表3 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞HIF-1α和ABCG2表达的影响

图3 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞HIF-1α和ABCG2的表达

表4 不同浓度川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞VEGF、HIF-1α、ABCG2 mRNA表达的影响

3 讨论

中草药对肿瘤细胞具有抑制作用，其可能是通过抗肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，调节相关信号通路［2-4］。川芎是一种活血药，常用于活血行气，祛风止痛，活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症，近年来发现川芎嗪具有抗肿瘤的作用，其主要的有效成分就是川芎嗪。有研究报道，肿瘤组织中存在着少数具有自我更新能力的细胞就是肿瘤干细胞，是肿瘤发生、发展、复发的根源，当机体肿瘤干细胞高度表达时，就会出现肿瘤的转移［5］。肺癌干细胞比普通肺细胞更容易突变转化为癌细胞，经过多次突变就会转变为肺癌干细胞。

目前，干细胞表面标志相关基因主要有Oct-4、Sox-2、Nanog［6］。Oct-4是POU家族的转录因子，Sox-2属于Sox家族成员，Nanog于胚胎干细胞中被发现，在维持干细胞干性的自我更新及多能性等方面发挥着关键作用。因此广大学者认为这三种转录因子的表达是区别其他普通肿瘤细胞的标志之一。本研究结果显示，Oct-4、Sox-2、Nanog三种转录因子在PG-BE1干细胞样细胞的表达高于其原代细胞，差异有统计学意义。

低氧诱导因子（HIF）-1是存在于低氧微环境中作用于细胞核的的转录调控因子，在肿瘤生成与转移、肿瘤干细胞干性维持、血管生成等方面起着重要作用，其过度表达会促进肿瘤干细胞的生长增殖。HIF-1α是HIF-1的特异性氧调节亚单位，可以通过刺激Oct4、Sox2等关键基因促进肿瘤干细胞样细胞的维持，促进肿瘤干细胞样细胞浸润、侵袭、转移，上调转录因子表达［7］，还参与肿瘤血管的生成，刺激血管生成因子分泌，通过抑制HIF-1α基因的表达，来协调其下游的血管内皮生长因子（VEGF）的表达［8］。HIF-1α在正常组织中不表达，而在肺癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤组织中过度表达［9-11］。本实验研究中，western blot结果显示不同浓度的川芎嗪对HIF-1α有一定的抑制作用，而RT-PCR实验也进一步证明了这一点，提示川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的抑制作用可能与HIF-1α表达有关。

VEGF是目前发现的最强烈的血管生成因子，存在于人体的各个器官组织，在缺氧环境下，癌基因和抑癌基因会对VEGF进行调节，增加VEGF表达［12］。目前报道，正常组织中VEGFmRNA表现为阴性，而在恶性肿瘤组织中则表达为阳性。而VEGF是HIF-1α分子介导的肿瘤发生过程中密切相关的基因之一，是HIF-1α最重要的靶基因，HIF-1α高表达时会上调VEGF基因的表达，因为HIF-1是VEGF的主要刺激因子。VEGF会导致血管通透性增强，加快肿瘤细胞转移的进程，另外肿瘤细胞也可以通过合成、分泌VEGF，再反过来促进肿瘤血管的生长［13］。血管生成推动了肿瘤的发生发展，为肿瘤细胞的增长创造了有利条件，加速肿瘤的生长、转移等［14-15］。川芎嗪等活血药能降低肿瘤的微血管密度，抑制肿瘤细胞VEGF表达，对肿瘤血管的生成产生一定的抑制作用。HIF-1α是肿瘤发生、发展的重要标记物，而VEGF是其重要的靶基因，因此准确检测HIF-1α、VEGF将对肺癌的临床工作具有重要意义。本实验通过ELISA实验检测，显示不同浓度的川芎嗪均抑制PG-BE1干细胞样细胞的VEGF的表达，RT-PCR结果显示川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的VEGF mRNA的表达也有作用，推测其作用机制可能是通过抑制HIF-1α基因的表达，进一步抑制VEGF的表达。

ABCG2是三磷酸腺苷结合盒转运体（ABC）转运家族的一种转运蛋白，主要存在于细胞膜上，在维持机体正常生理功能和细胞自身结构方面发挥着重要作用，其在正常人胚胎干细胞中并不表达，而对肿瘤则会导致其耐药，它的过度表达与肿瘤密切相关，被认为是肿瘤干细胞的标记物［16］。ABC转运蛋白通过ATP水解释放能量来使细胞中的能量、代谢物、药物等物质逆浓度梯度渗出洗胞外面，而川芎嗪具有阻滞Ca2+活性的功能，可能通过抑制ATP依赖的转运蛋白的表达来起到逆转耐药的作用［17］。本实验研究以ABCG2蛋白作为肿瘤干细胞标志物，观察川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的作用，western blot检测结果显示不同浓度的川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的ABCG2表达均有一定的抑制作用，进一步经PT-PCR检测后发现，川芎嗪可明显抑制ABCG2 mRNA的表达，western blot与PT-PCR的结果基本一致。川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞的杀伤作用可能是通过抑制ABCG2蛋白在mRNA水平上的表达实现的。

本研究结果显示，无血清培养法可以有效聚集PG-BE1干细胞样细胞，相对于原代细胞而言，PG-BE1干细胞样细胞的HIF-1α、VEGF表达均上调，具有更强的促血管生成能力，其表面高表达ABCG2转运蛋白，比普通细胞的耐药性更强。表明川芎嗪对PG-BE1干细胞样细胞HIF-1α、VEGF、ABCG2表达在某种程度上有一定抑制作用。

肿瘤干细胞是引起肿瘤细胞增殖、转移、耐药、复发的根本原因，近年来对干细胞的研究越来越多越来越深。中医药是我国的瑰宝，有效的运用中医药来调控治疗肿瘤是一种好的治疗方法。而在研究肺癌干细胞的领域中，还有许多问题亟待解决，需要广大学者的积极努力探索。