尿液基质降低尿路感染大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性

汤锡昌，陈 露，漆 涌，唐少华，罗 振

（1.中南大学湘雅三医院检验科，长沙 410013，2.湖南师范大学医学院检验系，长沙 410013）

随着抗菌药物、免疫抑制剂、激素及介入诊断和治疗措施的增多，尿路感染发生率显著升高。革兰阴性杆菌为尿路感染最常见致病菌，其中以大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli）最为常见。近年来，由于不合理应用抗生素导致细菌耐药性不断增强，导致感染性疾病的治疗更依赖于细菌鉴定及药敏结果。然而，即使选择体外敏感的药物，也存在治疗失败的可能。目前临床上对细菌进行体外药敏分析时，一般选择普通肉汤或0.5% NaCl溶液作为检测介质，仅考虑体外药敏结果而选择相应的抗菌药物是远远不够的，还要考虑抗菌药物的抑菌作用是否会受到其他因素的影响。有文献报道尿液可降低E. coli对环丙沙星的敏感性［1，2］，那么尿液基质是否影响其他类型抗生素的敏感性尚未见报道，本研究进行了初步的探讨。

1 资料与方法

1.1 VITEK-2 Compact药敏分析收集3～4份健康体检人群晨尿液等体积混合后作为一组，将收集好的尿液2000g离心10 min，上清液经0.22μm滤器过滤后，用MH肉汤或0.45% NaCl溶液配制成25%、50%、75%和100%的尿液基质。本研究中使用的尿路感染的E. coli分离株，经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDITOF MS）鉴定（Bruker质谱仪），其分值均高于2.0。采用VITEK-2 Compact和GN16药敏卡（法国梅里埃公司）进行常规药敏分析，按厂家推荐的方法进行操作，部分实验以不同浓度的尿液基质替代0.45% NaCl溶液进行药敏检测，以E. coli ATCC25922菌株作为质控菌株。

1.2 微量肉汤稀释法测定阿米卡星和庆大霉素的MIC直接从血平板培养过夜的单个E. coli菌落配成浓度为0.5 麦氏浊度（0.5 MCF）的菌悬液，再用MH肉汤或不同浓度的尿液基质1：100进行稀释，然后接种于96孔板中，并加入相对应浓度的阿米卡星或庆大霉素进行倍比稀释，然后置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养16～20h。药敏结果参考CLSI 2015［3］标准进行判读，以在第一个孔内完全抑制细菌生长的药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。根据获得的MIC值，判断E. coli的药物敏感性。

1.3 回顾性分析尿路感染E. coli的氨基糖苷类抗生素敏感性回顾性分析2015年1月1日～2015年12月31日期间于中南大学湘雅三医院检验科微生物室分离鉴定的471例尿路感染的E coli对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的敏感性。所有分离株均采用MALDI-TOF MS进行细菌鉴定，VITEK-2 Compact进行药敏检测。

2 结果

2.1 尿液基质降低大肠埃希菌ATCC25922对氨基糖苷类抗生素的敏感性采用梅里埃GN16药敏板检测E. coli ATCC25922菌株在含不同浓度的尿液基质中抗生素的MIC值，从而初步筛选出尿液基质对抗菌药物敏感性的影响。结果显示，E. coli在0.45% NaCl溶液基质中对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的MIC分别为≤2μg/mL、≤1μg/mL和≤1μg/mL，而在含25%尿液的基质中分别为8μg/mL、4μg/mL和4μg/mL，MIC值明显升高。随着尿液基质比例的增加，阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的MIC明显升高（见表1）。此外，环丙沙星MIC值随尿液基质比例的增加而增加，但升高幅度较慢，而对其他种类的抗菌药物的MIC值并未见明显改变（见表1）。

表1 尿液基质对E. coli ATCC25922抗菌药物敏感性分析

我们选择受尿液基质影响较大的阿米卡星和庆大霉素作为研究对象，采用微量肉汤稀释法进一步明确该两种抗生素对E. coli ATCC25922的MIC值。结果显示，阿米卡星和庆大霉素的MIC值随着尿液基质比例的增加而明显升高（见表2），与GN16药敏卡的初筛结果一致，说明尿液基质能显著降低E. coli对氨基糖苷类抗生素的敏感性。

表2 E. coli AT25922阿米卡星和庆大霉素在不同浓度尿液基质下的MIC值

2.2 尿液基质能显著降低尿路感染E. coli分离株对阿米卡星和庆大霉素的敏感性我们还检测了尿液基质对尿路感染E. coli分离株氨基糖苷类抗生素敏感性的影响，在普通MH肉汤基质中，5例尿路感染E. coli分离株阿米卡星的MIC值小于或等于2μg/mL，均表现为敏感。而在75%尿液浓度基质中，其MIC值均大于32μg/mL，表现为耐药（见表3）。随着尿液基质比例的增高，阿米卡星的MIC值相应的增加。同时我们还检测了庆大霉素的MIC值，也观察到相类似的结果（见表4），说明尿液基质能降低尿路感染E. coli分离株对阿米卡星和庆大霉素的敏感性。

表3 不同比例尿液基质中E. coli分离株阿米卡星的MIC值

表4 不同比例尿液基质中E. coli分离株阿米卡星的MIC值

2.3 回顾性分析尿路感染E. coli分离株对氨基糖苷类抗生素的敏感性我们回顾性分析2015年1月1日～2015年12月31日于中南大学湘雅三医院检验科微生物室分离鉴定出的471例尿路感染E. coli分离株对氨基糖苷类抗生素的敏感性。结果显示，阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的敏感率分别为93.5%、53.5%和53.5%；中介率分别为1.0%、2.4%和25.7%；耐药率分别为5.5%、43.9%和20.8%（见表5），说明尿路感染E.coli分离株对氨基糖苷类抗生素（尤其是阿米卡星）的敏感性较高。

表5 471例尿路感染E. coli分离株的氨基糖苷类抗生素的药敏分析

3 讨论

随着抗菌药物、免疫抑制剂、器官移植等治疗措施的增多，以及人口老龄化，尿路感染发生率显著升高［4-6］。此外，不合理使用抗生素导致尿路感染E. coli对各种常用抗生素的耐药情况明显增加［7-9］。因此治疗E. coli尿路感染时，需要根据尿液培养及药敏结果来选择合适的抗生素。本研究发现尿液基质可显著升高E. coli对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素MIC值。

对于尿液基质降低E. coli对氨基糖苷类抗生素敏感性的影响因素，本研究未进行深入的研究，可能是由于尿液中存在的代谢产物及其pH差异所致。常规微量稀释法所使用MH肉汤主要成份为牛肉粉、酸水解酪蛋白和可溶性淀粉，pH控制在25℃下为7.4±0.2。而健康人群的尿液成分中含有无机盐和有机盐，PH为6.0±0.5。文献报道，尿液的pH改变可显著影响环丙沙星的敏感性［1，2］。此外，E. coli在不同pH的尿液中的生长速度差异较大［10］。本研究中，我们也观察到尿液浓度的增加可导致环丙沙星MIC值显著升高，但是其升高的幅度稍低于文献报道［2］。此外，我们也检测了不同浓度尿液基质的pH，范围为6.0至7.4（未列出），远高于文献所采用的pH，说明还存在pH以外的其他因素。

本研究回顾性分析了2015年1月～2015年12月本院检验科微生物室分离培养得到471例尿路感染E. coli分离株对氨基糖苷类抗生素的敏感性，发现E.coli分离株对阿米卡星的敏感率最高，为93.5%，对庆大霉素和妥布霉素敏感率分别为53.7%和53.5%，与《2005-2014年CHINET大肠埃希菌耐药性监测》基本一致［11］。氨基糖苷类抗生素在感染性疾病中应用比较广泛［12］，其在体内不代谢，主要经肾小球滤过排出，在尿液中高达数百微克/毫升。最近的文献报道氨基糖苷类抗生素可用于儿童尿路感染产超光谱β-内酰胺酶（Extended Spectrumβ-lactamase，ESBL）E. coli的治疗［13］，但是由于氨基糖苷类抗生素可在肾脏皮质细胞和内耳液中积蓄，从而限制了其在儿童尿路感染中的应用。相对于喹诺酮类抗生素的高耐药性［14］，氨基糖苷类抗生素可应用于成人的复杂性的尿路感染。综上所述，对于氨基糖苷类抗生素治疗尿路感染E. coli需要慎重考虑。