应激在非条件性刺激诱导的恐惧记忆再巩固中的作用

丁如岚，黄诗豪，罗宜孝

（湖南师范大学医学院，长沙 410006）

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是与创伤经历有关的脑部疾病［1］，不仅损害个人健康，并且对社会发展也造成了严重的影响。然而，对于PTSD目前尚无有效的治疗方法。研究表明对条件性恐惧记忆的再巩固阶段进行干预，可以破坏条件性恐惧记忆，达到预防PTSD复发的目的［2-4］。应激对于记忆的不同阶段发挥了十分复杂的作用［5，6］，且应激是无创伤性疗法，不会带来如药物副作用等问题，将可能开辟一条PTSD治疗的全新途径。应激对UCS诱导条件性恐惧记忆的再巩固过程中的作用尚不明确。本研究采用条件性恐惧模型研究应激对UCS诱导的条件性恐惧记忆再巩固过程的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL/6J雄性小鼠（体重20～25g）购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0014。小鼠饲养在恒温（22±2）℃、湿度（约60%），12小时亮/暗循环（上午7点开始开灯）的动物房中，提供充足的水和饲料。小鼠在动物房适应饲养一周，每天进行适应性抓取。所有的动物实验操作都根据湖南省实验动物管理委员会和湖南师范大学的动物使用和保护伦理委员会的条例进行。

1.2 实验设备条件性恐惧记忆训练箱购自上海欣软技术有限公司。箱体底部为与电击发生器相连的金属杆，箱体四周为黑白相间的竖条纹。箱顶部有红外摄像头监控实验动物的僵直不动时间。动物视频分析系统（中国上海JLBeh软科有限公司所研制）监控，自动收集记录行为学资料。

1.3 实验方法

1.3.1 条件恐惧记忆模型（Contextual Fear Conditioning，CFC）

1.3.1.1 CFC训练训练前小鼠搬至条件性恐惧训练室，适应2小时后将小鼠放人恐惧箱内适应2分钟，给予小鼠3次足底电击（0.8mA），每次电击持续时间1s，间隔120s给予一次电击，末次电击后小鼠在训练箱停留1分钟。

1.3.1.2 CFC记忆测试将小鼠放在训练箱内，测试条件与训练一致，无电击，时间为5分钟，记录小鼠的僵直不动时间（freezing time）。僵直不动时间/总测试时间代表CFC记忆的强度。

1.3.1.3 非条件性刺激唤起（UCS retrieval）小鼠放入训练箱后立即给予小鼠1次低电流的足部电击（0.3mA，1s）进行唤起，电击结束后立即取出。

1.3.1.4 CFC记忆点燃测试（Priming test）点燃方法与唤起一致，点燃之后24小时进行CFC记忆测试。

1.3.1.5 CFC记忆自发恢复测试（Spontaneous recovery test）测试方法同CFC记忆测试。

1.3.2 冰水应激小鼠放入不透明的塑料圆柱体容器内自由游泳5分钟，只有头部露出水面。游泳容器直径和高度分别为20厘米和35厘米，其内冰水的高度为20厘米，温度为0±2 ℃。

1.3.3 数据处理实验均以结果以平均值±标准误（SEM）表示，以CFC训练后不同的处理方式作为组间因素，以不同的测试时间作为组内因素采用重复测量方差分析（repeated-measure ANOVA）分析各实验结果（见实验结果部分），选择Tukey‘s测试作为post hoc比较。P<0.05认为有显著统计学差异。

2 结果

2.1 非条件性刺激暴露后立即给予冰水应激对足底电击诱导的环境关联性条件恐惧记忆复燃的影响在实验1中，首先建立小鼠CFC记忆模型，根据不同的处理方式我们将小鼠分为两组：1）给予UCS暴露诱导的CFC唤起，应激组的小鼠足底电击暴露后（0.3mA）立即给予冰水应激（retrieval+ stress）；2）给予UCS暴露诱导的CFC唤起，非应激组的小鼠足底电击暴露后（0.3mA）后放回饲养笼（retrieval）。在第5天进行环境线索诱导的小鼠恐惧反应测试。第6天给予小鼠一次足底电击点燃，第7天进行小鼠恐惧反应的点燃测试（图1A）。实验结果采用rm-ANOVA分析，以不同的处理方式为组间因素（retrieval，retrieval+stress），以测试时间为组内因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。根据rm-ANOVA结果显示，组内因素 ［F（3，66）= 5.892，P= 0.001］、组间因素 ［F（1，22）=8.901，P = 0.007］以及交互效应 ［F（3，66）= 3.033，P = 0.035图1B］，均有显著性差异 ［图1B］，表明在UCS暴露唤起后立即给予冰水应激能破坏小鼠CFC记忆的再巩固过程，并且可以抑制足底电击点燃诱导的CFC记忆的复燃。

图1 非条件性刺激暴露后立即给予冰水应激抑制足底电击诱导的环境关联性条件恐惧记忆复燃。（A）实验流程。（B）小鼠环境关联性条件恐惧记忆测试的僵直不动时间百分比，与Retrieval组相比*P<0.05（n=12）。

2.2 非条件性刺激暴露后立即给予冰水应激对小鼠环境关联性条件恐惧记忆自发恢复的影响在实验2中，首先建立小鼠CFC记忆模型，根据不同的处理方式我们将小鼠分为两组：1）给予UCS暴露诱导的CFC唤起，应激组的小鼠足底电击暴露后（0.3mA）立即给予冰水应激（retrieval+ stress）；2）给予UCS暴露诱导的CFC唤起，非应激组的小鼠足底电击暴露后（0.3mA）后放回饲养笼（retrieval）。在第5天进行环境线索诱导的小鼠恐惧反应测试。测试后，小鼠放回饲养笼，14天之后测试CFC记忆的自发恢复情况，以观察UCS唤起后立即给予冰水应激对小鼠CFC记忆自发恢复的影响（图2A）。实验结果采用rm-ANOVA分析，以不同的处理方式为组间因素（retrieval，retrieval+stress），以不同的测试时间为组内因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。结果显示，组间因素 ［F（1，19）=1.071，P=0.031；图2B］、组内因素［F（3，57）= 13.865，P=0.000；图2B］以及交互效应 ［F（3，57）= 7.522，P=0.000］均有显著性差异 ［图2B］，表明在UCS暴露唤起小鼠CFC记忆之后立即给予冰水应激能破坏小鼠再巩固过程，并且可以抑制CFC记忆的自发恢复，其持续时间至少14天。

图2 非条件性刺激暴露后立即给予冰水应激抑制小鼠环境关联性条件恐惧记忆的自发恢复。（A）实验流程。（B）小鼠环境性恐惧记忆测试的僵直不动时间百分比，与Retrieval组相比，*P<0.05（n=10-11）。

2.3 不进行非条件性刺激暴露唤起给予冰水应激对小鼠环境关联性条件恐惧记忆的影响在实验3中，首先建立小鼠CFC记忆模型，根据不同的处理方式我们将小鼠分为两组：不给予UCS暴露诱导的CFC记忆唤起，应激组的小鼠给予冰水应激（no retrieval+ stress）；不给予UCS暴露诱导的CFC记忆唤起，非应激组小鼠在饲养笼不做处理（no retrieval）。在第5天进行环境线索诱导的小鼠恐惧反应测试。第6天给予小鼠一次足底电击点燃，第7天进行小鼠环境关联性条件恐惧反应的点燃测试（图3A）。实验结果采用rm-ANOVA分析，以不同的处理方式为组间因素（No retrieval，No retrieval+stress），以不同的测试时间为组内因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。结果显示，组内有显著性差异 ［F（3，66）= 5.407，P = 0.002；图3B］，然而组间［F（1，22）= 0.118，P = 0.734；图3B］以及交互效应［F（3，66）= 0.169，P = 0.917；图3B］均无显著性差异，表明在没有进行UCS暴露唤起恐惧记忆的情况下，冰水应激对小鼠恐惧记忆的表达无影响，说明冰水应激对UCS暴露诱导的恐惧记忆的再巩固过程的破坏作用具有唤起依赖性。

图3 不进行非条件性刺激暴露唤起给予冰水应激不影响小鼠环境关联性条件恐惧记忆的表达。（A）实验流程。（B）小鼠环境性恐惧记忆测试的僵直不动时间百分比。（n=12）

2.4 非条件性刺激暴露9小时后给予冰水应激对环境关联性条件恐惧记忆表达的影响在实验4中，首先建立小鼠CFC记忆模型，根据不同的处理方式我们将小鼠分为两组：给予UCS暴露诱导的CFC记忆唤起，应激组的小鼠在给予足底电击（0.3mA）9小时后给予冰水应激（retrieval + 9h + stress）；给予UCS暴露诱导的CFC记忆唤起，非应激组的小鼠在给予足底电击后（0.3mA）后放回饲养笼（retrieval+ 9h+ no stress）。在第5天进行环境线索诱导的小鼠恐惧反应测试。第6天给予小鼠一次足底电击点燃，第7天进行小鼠环境关联性条件恐惧反应的点燃测试（图4A）。试验结果采用rm-ANOVA分析，以处理方式为组间因素（retrieval+ 9h+stress，retrieval+ 9h+ no stress），以不同的测试时间为组内因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。组内因素有显著性差异 ［F（3，60）=11.853，P=0.000］，组间因素 ［F（1，20）= 0.518，P=0.480］以及交互效应［F（3，60）= 0.010，P=0.999］均无显著性差异 ［图4B］，表明在UCS暴露唤起CFC记忆之后9小时给予冰水应激对小鼠恐惧记忆的表达无影响，说明冰水应激对UCS暴露诱导的CFC记忆的再巩固过程的破坏作用具有时间特异性。

图4 非条件性刺激暴露9小时后给予冰水应激不影响环境关联性条件恐惧记忆表达。（A）实验流程。（B）小鼠环境性恐惧记忆测试的僵直不动时间百分比。（n=11）

3 讨论

本研究采用经典的小鼠条件恐惧记忆模型，验证了应激对UCS诱导的CFC记忆再巩固过程的作用。UCS暴露唤起CFC记忆后立即给予冰水应激可以有效地降低小鼠的条件性恐惧反应在足底电击点燃诱导的复燃以及自发恢复现象；但是在UCS暴露唤起条件性恐惧记忆后9小时给予冰水应激或者在不给予UCS暴露的条件下给予冰水应激则不影响小鼠恐惧记忆的表达。我们的研究结果发现应激对UCS诱导的CFC记忆的影响具有明显的时间特异性和UCS唤起依赖性，与之前大量干预记忆再巩固过程的研究特点一致［7，8］。

在应激的条件下，肾上腺皮质激素进入中枢神经系统能够对记忆的巩固、唤起和再巩固过程产生复杂的影响［9-11］。应激对于记忆不同过程的作用，前期的研究结论存在争议，一些研究表明应激可以破坏CS暴露诱导的再巩固过程［6］。我们发现在UCS暴露诱导的再巩固过程中，给予冰水应激可以有效地抑制条件性恐惧记忆在不同条件下出现的复燃现象，并且应激对于UCS诱导的条件性恐惧记忆的破坏作用至少可以持续14天，与应激对CS诱导记忆再巩固过程的作用一致。糖皮质激素会影响β-肾上腺素受体介导的腺苷3，5-环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和cAMP依赖性蛋白激酶（protein kinase，PKA）的形成，从而影响cAMP/PKA信号转导通路的激活［12］。记忆被激活之后进入再巩固阶段依赖cAMP/PKA信号转导通路的活性［13，14］。此外，β-肾上腺素受体拮抗剂普萘洛尔被用来干预条件性恐惧记忆以降低PTSD患者的创伤性体验的重现［15］。因此，我们的研究结果发现应激对UCS诱导的条件性恐惧记忆再巩固过程的破坏作用可能与β-肾上腺素受体-cAMP/PKA系统有关。

本研究首次证实了应激破坏UCS暴露诱导的CFC记忆再巩固过程，有效地抑制了小鼠的恐惧反应在点燃和自发恢复条件下的复燃，但是其确切的神经生物学机制尚需进一步研究。应激作为一种非侵入性和非药理学的干预手段，避免了破坏条件性恐惧记忆过程使用药理学干预手段如使用工具药物等所带来的毒副作用对临床应用的限制，可能成为有前景的治疗PTSD的新手段。