MiR-152-3p以TGFA为靶向调控甲状腺乳头状癌的发生

余敏兰，胡国潢

（湖南师范大学附属长沙医院/长沙市第四医院，长沙 410006）

甲状腺癌在颈部肿瘤中发病率居首位［1］，来源于滤泡上皮细胞［2］，其最高发的类型是乳头状癌（PTC），占60%～70%以上［3］。虽然PTC的预后大多良好，但仍有一部分患者术后复发、淋巴结转移或远处转移［4］。因此对PTC的诊疗及靶点进行进一步研究就尤为重要［5］。MicroRNA（miRNA）能调控动植物基因表达，其机制是通过和靶mRNA的3’端互补配对，在靶基因转录后抑制其表达。许多研究发现，miRNA与PTC的发生有密切联系，梅士娟等人通过研究138例实验组（PTC患者组）与等量对照组发现miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲状腺癌中表达升高，且与癌症发展有很大联系，三者联合可提高诊断的敏感度、特异度、准确度［6］。本研究观察了miR-152-3p在PTC组织及细胞株中的表达变化，初步探讨miR-152-3p靶向TGFA调控PTC，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本的收集本研究以术后病理诊断为甲状腺乳头状癌为诊断标准，共收集了20对术后PTC组织和癌旁甲状腺组织样本。术后30分钟内在液氮冷冻保存。所有患者术前均未接受其它针对肿瘤的治疗，签署知情同意书。甲状腺乳头状癌KTC-1细胞购自上海素冉生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂Trizol购自Invitrogen；RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit购自 Fermenta；mimics、inhibitor、Pegfp-C1-TGFA 和 SiRNA-TGFA 购自Gene Pharma；CCK-8试剂盒购自上海Beyotime公司 ；Matrigel购自 BD ；Anti-TGF alpha、Anti-β-actin和Goat Anti Rabbit IgG/HRP二抗购自Boster；miRNA Q-PCR检测试剂盒购自GeneCopoeia；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染将KTC-1细胞接种在6孔板上，加入2mL基础培养基。等待细胞汇合达到70%。转染分组如下：①NC组、miR-152-3p-inhibitor组、miR-152-3p-mimics组；②NC组、SiRNA-TGFA（KO）组、Pegfp-C1-TGFA（OE）组。

1.2.2 Realtime-PCR将收集的组织或细胞样本，取1mL Trizol加入处理后的样品提取总RNA，去除基因组DNA，反转录后实施定量PCR检测，每个样本设置三次重复，引物见表1。

PCR反应预变性95℃，5min。开始循环，变性95℃，10s；退火Tm-5℃，20s；延伸72℃，10s；共40个循环。采用2-△△Ct值计算目的基因的相对含量（RQ）。

1.2.3 细胞增殖能力检测收集分组转染的KTC-1，每组设置3个平行复孔，1个本底对照孔。每孔加入10μL CCK-8，培养0、12、24、48和72h后进行检测，在450nm波长处，测定吸光度（OD值）。

表1 PCR引物

1.2.4 细胞划痕实验取对数生长期KTC-1细胞，根据需要干预分组，培养至细胞铺满6孔板孔底。第二天用20微升无菌枪头垂直在细胞中划一条直线，每孔洗涤三次，去除划掉的细胞，加入无血清培养基，测量0h划痕相对宽度作为对照，继续培养48h后测量宽度，计算48h/0h宽度比。

1.2.5 细胞侵袭实验将BD Matrigel 预先聚合成凝胶。取转染后的分组细胞，以SFM培养基重悬，调整细胞密度至5×104/mL，接种于预铺了Matrigel胶的Transwell上室，下室加入含胎牛血清（FBS）的培养基，孵育24h后擦去基质胶和上室内细胞，酒精固定苏木精染色，显微镜下计数细胞。

1.2.6 Western blot收集各组细胞，加RIPA裂解细胞，提取总蛋白，加入loading buffer滚水浴使蛋白质变性。加样，电泳，转移到硝酸纤维素（NC）膜上，加入Anti-TGFA（1：1000），4℃过夜，第二天加入 Goat Anti Rabbit IgG/HRP（1：4000），室温孵育2h；显影后灰阶分析，以β-actin为内参，蛋白相对表达量即为TGFA与β-actin条带灰度值的比值。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测取KTC-1分组细胞：NC组及miR-152-3p mimics，共转染入报告基因载体和TGFA 3ˊ-UTR，在24孔板中充分裂解细胞。在细胞中加入萤火虫荧光素酶溶液，测量强度值。结束后更换海肾荧光素酶工作液，读数海肾荧光强度值，算得比值，分析荧光素酶活性。

1.3 统计学分析采用统计软件SPSS 20.0对所有的实验数据进行统计分析。实验数据波动范围用平均值±标准差表示。t检验被用以比较两组间的差异；方差分析用来进行两组以上的样本间差异比较，两两比较采用LSD法及SNK检验；P≤0.05为结果具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织中miR-152-3p和TGFA的表达Realtime-PCR分别检测了20例PTC癌组织和20例癌旁甲状腺组织的miR-152-3p表达水平。PTC样本中的miR-152-3p的平均水平明显低于癌旁组织（P<0.01）（如图1），TGFA在PTC组织中的表达量较癌旁组织明显上调（P<0.01）（图 2）。

图1 miR-152-3p在PTC癌组织和癌旁组织中的表达差异与癌旁组织比较，*P<0.01

图2 TGFA在PTC癌组织和癌旁组织中的表达差异与癌旁组织比较，*P<0.01

2.2 miR-152-3p抑制KTC-1细胞的增殖对PTC细胞不同分组进行研究。如图3示，KTC-1细胞各分组在0h、12h、24h、48h、和72h的增值率各不相同，细胞增殖率的计算方法：（实验组OD值-本底OD值）/（对照组OD值-本底OD值）×100%。miR-152-3p模拟物转染组显著抑制KTC-1细胞的增殖（P<0.05），miR-152-3p抑制物转染组增强了KTC-1细胞的增殖（P<0.05）。

2.3 miR-152-3p对KTC-1细胞迁移的影响通过细胞划痕实验检测癌细胞迁移能力，划痕宽度越小，相对宽度比值越小，迁移能力越强。结果显示，miR-152-3p-inhibitor组48h/0h宽度为0.5641明显低于NC组（P<0.05）；miR-152-3p-mimics组48h/0h宽度为0.7863，明显高于NC组（P<0.05），表明，miR-152-3p的高水平表达抑制了细胞迁移，miR-152-3p低表达和功能抑制时却促进了细胞迁移（表2）。

2.4 miR-152-3p抑制KTC-1细胞的侵袭Transwell小室法检测肿瘤细胞侵袭能力，如图4所示，miR-152-3p-inhibitor组细胞较阴性对照组明显增多（P<0.05），而miR-152-3p-mimics组细胞减少（P<0.05）。此实验表明miR-152-3p可抑制KTC-1细胞的侵袭过程。

图3 CCK-8法检测KTC-1细胞增殖与NC组比较，*P<0.05

表2 KTC-1细胞划痕相对宽度比值

图4 miR-152-3p影响KTC-1细胞侵袭过程细胞为苏木素染色，放大倍数200×

2.5 TGFA为miR-152-3p的靶点Targetscan、Mirdb、Mirtarbase软件搜索miR-152-3p的潜在靶点，通过韦恩交集图筛选出评分较高的靶基因TGFA。将二者结合位点3ˊ-UTR端区域构建至Luciferase下游，转染miR-152-3p mimics和NC至KTC-1细胞后，行双荧光素酶基因检测，结果显示，mimics转染组的荧光强度弱于NC组细胞（图5）。说明miR-152-3p与TGFA存在互补结合从而影响荧光素酶基因活性。

图5 miR-152-3p模拟物与TGFA的WT或MuT 3ˊ-UTR共转染到KTC-1，行荧光素酶报告基因测定。数据统一标准化到NC转染的对照组KTC-1细胞的荧光素酶活性，*P<0.01

将各组PTC细胞通过qPCR和WB检测分别检测TGFA的mRNA和蛋白表达，实验结果表明，与阴性对照组比较，miR-152-3p模拟物组能显著下调TGFA的mRNA（P<0.001）和蛋白表达；而转染miR-152-3pinhibitor组的细胞中，TGFA的mRNA（P<0.001）和蛋白表达明显上调（图6、7）。

图6 TGFA在KTC-1细胞中的mRNA表达与NC组比较，*P<0.001

图7 TGFA蛋白表达，β-actin作为内参蛋白对照

2.6 TGFA促进PTC细胞增殖和侵袭进一步行细胞实验，取KTC-1细胞NC组、TGFA（KO）组和TGFA（OE）组，分别检测细胞增殖及侵袭能力。结果表明，相对于阴性对照组，如图8、9，TGFA过表达后，能够促进PTC细胞增殖（P<0.01）和细胞侵袭。

3 讨论

本研究将miR-152-3p与PTC联系起来，得到一系列实验成果：首先，miR-152-3p在PTC组织和细胞中下调；其次，PTC细胞的增殖因miR-152-3p的过表达而受到抑制，癌细胞的迁移能力也因此被克制，侵袭能力同样减弱；再次，miR-152-3p通过与TGFA互补结合单向抑制TGFA的表达，从而抑制PTC细胞的生长；最后，TGFA促进PTC细胞的增殖和侵袭的作用。结果表明miR-152-3p是PTC发生的负调控因子，在其他类型的肿瘤中miR-152-3p也被阐明发挥类似作用，如胶质母细胞瘤［7］、前列腺癌［8］、肝癌［9］等。了解miRNAs如何与靶mRNA相互作用以及这种相互作用的后果，能够使我们进一步了解这些调控对细胞命运和功能的生物学影响。

图8 CCK-8法检测细胞的增殖与NC组比较，*P<0.01

图9 Transwell法检测侵袭细胞数细胞为苏木素染色，放大倍数200×

众所周知，TGFA可在恶性肿瘤进展过程中发生过表达［10］。那么，对其调控基因的发掘非常重要。miRNA负调控基因表达［11］。结合靶基因预测网站和既往文献报道，我们发现，TGFA可能是miR-152-3p在PTC发病机制中的靶点之一，miR-152-3p通过结合TGFA的3ˊ-UTR端非编码区序列，调控靶基因TGFA的表达水平。然而，我们发现干扰TGFA或过表达TGFA，miR-152-3p的表达是不被影响的，表明TGFA并不反向作用于miR-152-3p，但TGFA能促进PTC细胞增殖和侵袭等生物学行为，继而影响甲状腺乳头状癌的发生发展，miR-152-3p的调控作用能减缓TGFA诱导肿瘤生长的过程。

许多研究者们在肿瘤中检测TGFA，非小细胞型肺癌（NSCLC）细胞的增殖因TGFA的表达下调被抑制了［12］；在卵巢癌中TGFA影响细胞的生长和迁移［13］；乳腺癌细胞要侵袭胶原基质则需要TGFA信号［14］。

我们目前研究表明，TGFA可以诱导PTC细胞的增殖和侵袭，而miR-152-3p可以通过调节TGFA的表达，对KTC-1细胞系产生一定影响。但关于TGFA在体内促进作用的具体机制或通过何种信号通路起到该作用还有待进一步阐明。PTC存在多种组织学变异［15］，但此次研究样本量较少，难以准确定义每个PTC变体中miR-152-3p的表达。因此，需要在更独立、更大量的患者中进一步研究。虽然甲状腺乳头状癌大多相对惰性，故预后良好，术后10年无病生存率为90%以上［16］，但仍存在侵袭及转移的可能，容易发生颈部淋巴结转移，将近10%的病患术后会出现肿瘤复发、远处转移乃至死亡。因此，研究miR-152-3p的表达情况在预测肿瘤发生的可能及颈部淋巴结转移方面有一定意义。

总的来说，本研究表明miR-152-3p通过靶向TGFA显著抑制PTC癌细胞的生长、迁移和侵袭，这是关于miR-152-3p的一个新发现。同时，这种模式为甲状腺乳头状癌的发病机制提出了新的见解，有助于更好地理解TGFA的作用。miRNA在早期诊断、复发可能性和预后评估等方面的价值已被认可［17］，或将发现miR-152-3p能用于研发靶向治疗等。