血清中8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC对脑卒中患者的诊断价值

龙云霞

脑卒中是一种严重威胁人类健康的急性脑部常见疾病,一般分为缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)和颅内出血(intracerebral hemorrhage,ICH),IS的发病率高于ICH,总占比高达60%～70%。脑卒中是致残致死的主要常见疾病之一,其发病人数逐年明显增多[1]。脑卒中有不同的类型,在治疗和预后方面存在较大差异,目前缺乏有效的治疗方法。目前,临床上主要依据脑血管造影、CT等仪器数据来诊断脑卒中,这种方法存在检测费用高、仪器设备要求高等缺点,生化检测方面仍缺乏灵敏的指标。脑卒中的病理过程十分复杂,其中普遍支持的病理机制之一是由氧化应激产生的自由基对脑部产生了一定的损伤而引发脑卒中[2]。自由基会引起脂质发生过氧化反应形成过氧化物,其中8-羟基脱氧鸟苷酸(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)对DNA和脂质氧化的损伤最严重,二者的血清含量可直接反映氧化应激的效应大小[3];超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是机体抗氧化体系的重要成分之一,能清除由氧化应激产生的自由基等有害物质,总抗氧能力(total antioxidant capacity,T-AOC)是人类抗氧化体系抗氧能力的总称,有酶类性质的抗氧化物质,也有部分是非酶类性质的抗氧化物质,是反映机体对抗氧自由基的重要参数。笔者检测脑卒中患者血清8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平参数的变化,分析四项指标在脑卒中早期诊断中的临床意义和应用价值。

临床资料与方法

一、一般资料

纳入标准:(1)原发IS和ICH。(2)患者发病<12 h。(3)均经X线或NMR成像(NMR Imaging)证实。(4)诊断符合1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的《各类脑血管病的诊断要点》[4]。排除标准:排除脑栓塞及严重心、肝、肾疾病患者,近期(≤1个月)有严重感染史、手术史及外伤史者,血液病、结缔组织病、脑出血及其他系统自发性出血者,近期(≤1个月)服用影响凝血功能药物者。

共纳入2016年7月至2018年6月胶州市人民医院收治的脑卒中患者200例,依据头颅CT和(或)MRI分为IS组102例,其中男性65例,女性37例;年龄46～68岁,平均(57.2±5.8)岁,包括脑栓塞和脑血栓形成。ICH组98例,其中男性70例,女性28例;年龄46～69岁,平均(56.8±5.6)岁,包括脑出血和蛛网膜下腔出血。同时选取胶州市人民医院的95名健康者作为正常对照组,其中男性65名,女性30名;年龄49～70岁,平均(57.5±6.1)岁。三组间性别、年龄进行统计学分析,差异无统计学意义(P>0.05)。

二、方法

(一)标本采集

对照组空腹12 h后,用普通干燥管采集三组成员的静脉血5 mL,25℃下静置1 h后,在3 000 r/mim,4℃离心20 min,取出血清置于已做好编号的离心管中,于-80℃密闭保存(保存时间可达1年以上)。尽量不要反复解冻使用。规范样本采集、保存和离心时的标准操作要求,样本保存时要编写清楚信息且静置一段时间,离心时将血清与脂质完全分离,避免溶血等对检测结果的影响。

(二)测定方法

1.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中8-OHdG、MDA和SOD的含量,相应的ELISA试剂盒均购自于美国Thermofisher,操作严格按照试剂盒使用说明书,设有复孔。患者离心冷冻的血清6个月时检测1次,共检测2次。每次检测均使用同一批次的酶联试剂盒和由相同的实验员操作,提高实验人员的检验技能,了解方法的检验原理和注意事项,保证结果的均一性。

2.血清T-AOC测定采用菲啉类物质比色法检测,试剂盒购买于上海生工生物工程技术有限公司,比色法使用721可见光分光光度计(北京普雷德仪器设备有限公司)进行含量的检测。检测过程严格遵循试剂盒和仪器使用说明书。

三、统计学分析

结 果

一、三组8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平比较

IS和ICH组血清8-OHdG水平分别为(18.1±9.4)ng/mL、(8.9±2.4)ng/mL,MDA水平分别为(6.2±2.2)ng/mL、(6.9±1.9)ng/mL,与正常对照组比较,IS 组及ICH 组血清8-OHdG和MDA水平均升高(P均<0.05);SOD水平分别为(65.2±10.5)ng/mL、(48.2± 9.8)ng/mL,T-AOC水平分别(14.8±4.1)U/mL、(9.5±3.9)U/mL,与正常对照组比较,SOD和T-AOC水平减少(P<0.05)。IS组血清8-OHdG、SOD和T-AOC都比ICH组低(P均<0.05),而MDA水平2个组之间无统计学差异(P均>0.05)。见表1。

表1 IS组、ICH组和正常对照组血清8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平的比较

二、 8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断IS与健康者的AUC、灵敏度、特异度和截断

为了评估8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC在IS病患者与健康者中的诊断价值,绘制102例IS患者和95例健康者的ROC曲线(图1)。8-OHdG的受试者工作特征曲线的AUC为0.81±0.05(95%CI:0.73～0.94),以8-OHdG的阳性临界值,其诊断灵敏度为81%,特异度为84%;MDA的受试者工作特征曲线的AUC为0.83±0.02(95%CI:0.89～0.96),以MDA的阳性临界值,其诊断灵敏度为85%,特异度为82%;SOD的受试者工作特征曲线的AUC为0.82±0.06(95%CI:0.76～0.93),以SOD的阳性临界值,其诊断灵敏度为77%,特异度为89%;T-AOC的受试者工作特征曲线的AUC为0.81±0.05(95%CI:0.79～0.94),以T-AOC的阳性临界值,其诊断灵敏度为75%,特异度为91%。见图1、表2。

图1 8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断IS与健康者的ROC曲线

表2 8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断IS与健康者的AUC、灵敏度、特异度和截断值

三、8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断ICH与健康者AUC、灵敏度、特异度和截断

为了评估8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC在ICH病患者与健康者中的诊断价值,绘制102例IS病患者和95例健康者的ROC曲线(图2)。8-OHdG的受试者工作特征曲线的AUC为0.73±0.05(95%CI:0.6824～0.9281),以8-OHdG的阳性临界值,其诊断灵敏度为82%,特异度为71%;MDA的受试者工作特征曲线的AUC为0.76±0.06(95%CI:0.6103～0.8698),以MDA的阳性临界值,其诊断灵敏度为67%,特异度为84%;SOD的受试者工作特征曲线的AUC为0.80±0.06(95%CI:0.6492～0.9102),以SOD的阳性临界值,其诊断灵敏度为79%,特异度为79%;T-AOC的受试者工作特征曲线的AUC为0.80±0.05(95%CI:0.6125～0.9217),以T-AOC的阳性临界值,其诊断灵敏度为81%,特异度为72%。见图2,表3。

四、脑卒中患者8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平相关性分析

8-OHdG与MDA、SOD和T-AOC水平呈正相关(r值分别为0.35、0.75、0.64,P<0.01),MDA与SOD无相关性(r=0.12,P>0.05),MDA与T-AOC呈正相关(r=0.34,P<0.05)。见图3～7。

图2 8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断ICH与健康者的ROC曲线

表3 8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC诊断ICH与健康者的AUC、灵敏度、特异度和截断值

图3 8-OHdG与MDA的相关性分析

图4 8-OHdG与SOD的相关性分析

图5 8-OHdG与T-AOC的相关性分析

图6 MDA与SOD的相关性分析

图7 MDA与T-AOC的相关性分析

五、脑卒中严重程度相关的多因素Logistic回归分析结果

将单因素分析有统计学意义的变量纳入Logistic回归方程中,在排除其他因素影响后,与严重程度明显相关的变量有8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC,结合临床提示8-OHdG和T-AOC与脑卒中密切相关且是脑卒中的保护性因素;MDA和SOD与脑卒中密切相关且是脑卒中的危险因素。见表4。

表4 脑卒中严重程度相关的多因素Logistic回归分析

讨 论

脑卒中是脑血管循环障碍性急症,全球每年死亡人数高达六百万例,脑卒中患者风险率约为8%～10%[5]。脑卒中病理机制涉及反应通路较多,其中,氧化应激产生的过多自由基是造成组织细胞中DNA、蛋白质和脂质破坏的重要原因[6]。患者体内过多的活性氧或自由基等有害化学基团削弱线粒体的正常功能,增加对脑细胞的副作用,加重神经元各种大分子物质,如DNA、蛋白质和脂肪的化学反应,从而引发机体的过氧化损伤和炎症现象等,其中产生的氧化产物可以稳定地反映脑卒中患者的氧化应激程度,另外也能作为机体氧化应激以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的评估标准[7]。抗氧化物质是一组能与氧自由基发生化学反应,从而有效降低机体过多的氧自由基,减弱氧自由基对机体脑细胞的损伤作用,对于脑组织和神经元起着重要的保护作用[7],抗氧化能力也可从侧面反映机体的氧化应激水平,可作为氧化应激水平的检测指标。本文结果显示,与正常对照组相比,IS组及ICH组血清SOD和T-A水平明显下降,且比较具有显著性差异(P均<0.05),而IS组及ICH组血清8-OHdG和MDA水平明显上升,差异有统计学意义(P均<0.05)。此结果符合脑卒中氧化应激发生机制,因此及早发现,及早干预,预后效果会比较理想。

8-OHdG是羟自由基在DNA分子碱基的C4、C5以及C8上与脱氧鸟嘌呤核苷酸残基结合发生氧化反应生成的产物,这个过程导致DNA分子发生了一定的结构损伤,因此,8-OHdG是氧化应激引起机体损伤的反应产物,可以用来评估机体DNA损伤的严重程度[8-11]。MDA是氧自由基与细胞膜不饱和脂肪酸发生氧化还原反应所形成的一种物质,当MDA超出正常范围时,表明氧自由基发生的反应效能大,同时体现氧自由基作为反应物质之一的含量也比正常人高,因此MDA能侧面体现出氧自由基含量的变化情况[12-13]。本研究对比分析出血性脑卒中和缺血性脑卒中患者血清8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平显示,IS和ICH虽然是两种类型不同的脑卒中疾病,理论上它们在发病机制以及后期临床表现均有所不同,但是在发病期间均有大量自由基产生(包括8-OHdG和MDA)但抗氧化物质的锐减(包括SOD和T-AOC)。而且两组血清8-OHdG和MDA水平都比正常对照组高,SOD和T-AOC水平也比正常对照组低,尤其是出血性脑卒中患者体内自由基和抗氧化物质的变化更明显(P<0.05)。提示出血性脑卒中患者在氧化应激过程中,机体神经及组织氧化损伤更严重。相对应出血性脑卒中患者SOD和T-AOC水平高于缺血性脑卒中患者(P<0.05),这可能是由于缺血性脑卒中患者体内由于过多的自由基成分导致机体做出相应的抗氧化反应,促使抗氧化物质大量降低,也可能是自由基严重抑制了抗氧化物质的生物活性[14],从而导致其含量减少,与脂质过氧化物的反应能力降低,从而中和氧自由基过剩含量的能力不如出血性脑卒中患者。在本研究中,发现IS与健康者的8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC的灵敏度分别为81%,85%,77%,75%;特异度分别为84%,82%,89%,91%。ICH与健康者的8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC的灵敏度分别为82%,67%,79%,81%;特异度分别为71%,84%,79%,72%。显示了8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC在IS和ICH中的较高诊断效能。

脑卒中患者血清8-OHdG、SOD和T-AOC的相关性分析结果显示。8-OHdG与MDA、SOD和T-AOC呈正相关(r值分别为0.35、0.75、0.64,P<0.01),且8-OHdG与MDA的相关程度相比8-OHdG与SOD和T-AOC相关程度较低,表明脑卒中患者机体DNA发生损伤产生8-OHdG时,脂质氧化程度相对较弱。同时也说明发生氧化应激时,伴随抗氧化作用明显加强。另外,MDA与SOD无相关性(r=0.12,P>0.05),MDA与T-AOC呈正相关(r=0.34,P<0.05),表明机体氧化应激产生的MDA并不直接被SOD反氧化清除,而是有可能被其他抗氧化物质作用清除,所以与T-AOC的相关性相密切。与此同时,本研究发现8-OHdG和T-AOC与脑卒中密切相关且是脑卒中的保护性因素;MDA和SOD与脑卒中密切相关且是脑卒中的危险因素。总之,8-OHdG、SOD和T-AOC与脑卒中发病存在着较密切的内在联系。

综上所述,血清8-OHdG、MDA、SOD和T-AOC水平可直接反映脑卒中患者的氧化应激状态,对脑卒中患者及早确诊及后期治疗方面具有重要意义,同时说明机体内氧化体系与抗氧化体系的失衡是造成脑卒中的重要原因之一,对于临床及早使用自由基清除剂,从而阻止脑细胞的过度损伤具有重要的指导意义。