紫外分光光度法测定蚓激酶效价方法研究

李岚 李文贵 周清瑶 秦巧莉

（江中药业股份有限公司 江西南昌330004）

蚯蚓纤溶酶（Earthworm Fibrinolytic Enzyme, E FE）又称作蚓激酶（Lumbrokinase,LK），是从赤子爱胜蚓体内提取的一组具有纤溶活性的蛋白水解酶。自1983 年Mihara 等从蚯蚓粗提物中分离到一组具有纤溶酶活性的蛋白质以来，蚓激酶作为溶栓药物已先后在韩国和中国上市，对血栓性疾病有明显的疗效[1]。平板法是目前较为常用的定量方法，用于蚓激酶效价的测定。但在实验操作中，铺板、打孔、点样和计数时出现导致操作误差，并且该检测方法耗时长、效率低，检测使用的蚓激酶标准品、凝血酶和牛纤维蛋白原等试剂成本较高。蚓激酶中的蛋白质在碱性溶液中会与Cu2+鳌合，形成肽-铜复合物，此复合物可使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650 nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，再以蚓激酶标准品作为对照可计算样品效价。紫外分光光度法的建立正是基于以上原理。现报道如下：

1 仪器与材料

1.1 仪器 MS204-S 电子天平（瑞士梅特勒-特利多公司）；UV2550 紫外分光度计（日本岛津公司）；旋涡震荡器（江苏金坛亿通电子有限公司）。

1.2 试药与试剂 蚓激酶标准品［215 000 U/支，为江中药业股份有限公司自制，批号为201809，使用中国食品药品检定院蚓激酶标准品（编号140650-200502） 进行标定］；蚓激酶干粉（批号18100004-1、18100005-1、18100005-2）、30 万蚓激酶肠溶胶囊（批号18090023、18100024、18100027）和60 万蚓激酶肠溶胶囊（批号18110001、18110002、18110003）为江中药业股份有限公司提供；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 波长的选择[2～3]

2.1.1 标准品溶液的制备 取蚓激酶标准品1 支，用磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）制备成4 300 U/ml的蚓激酶标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取30 万蚓激酶肠溶胶囊（批号18090023）28.0 mg，用37 ℃磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）制成每1 ml 中含蚓激酶6 000 U 的溶液。另蚓激酶干粉（批号18100004-1），同法制备成0.5 mg/ml 的溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 称取14.0 mg 空白微丸、7.3 mg 肠溶包衣材料，溶于10 ml 磷酸盐缓冲液（pH 值6.8）中，作为阴性样品溶液。

2.1.4 测定 取以上溶液，分别在200～600 nm 波长进行扫描，阴性样品溶液未检出紫外最大吸收峰，30 万蚓激酶肠溶胶囊和蚓激酶干粉溶液紫外最大吸收峰波长均在约650 nm 处，因此，选取650 nm为最佳测定波长。见图1～图3。

图1 蚓激酶标准品光谱吸收图

图2 蚓激酶样品光谱吸收图

图3 阴性样品光谱吸收图

2.2 研究方法

2.2.1 标准品溶液的制备 取蚓激酶标准品1 支，用磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）制备成21 500 U/ml的标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 蚓激酶干粉取约10 mg（30 万蚓激酶肠溶胶囊取内容物约180 mg、60 万蚓激酶肠溶胶囊内容物约300 mg），精密称定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀备用。

2.2.3 标准曲线的制备 取标准品溶液，分别精密量取0、0.10 ml、0.30 ml、0.50 ml、0.70 ml、1 ml 置于10 ml 具塞试管中，分别加入磷酸盐缓冲溶液（pH值6.8）至1 ml。加入碱性Cu2+溶液5 ml，放置10 min。快速加入酚试剂0.5 ml，充分摇匀。30 ℃水浴30 min，取出放冷，在650 nm 波长依法测定。以样品量为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。结果表明在2 150～21 500 U 范围内，相关系数为0.996 3，线性关系良好。见图4。

图4 蚓激酶标准曲线

2.2.4 样品测定 取蚓激酶干粉、30 万蚓激酶肠溶胶囊、60 万蚓激酶肠溶胶囊各3 批，按照供试品溶液制备方法制备，分别精密量取0.50 ml（60 万蚓激酶肠溶胶囊取0.25 ml）具塞试管中，加入磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）至1 ml 依法测定。效价测定结果见表1。

表1 样品效价测定结果

2.3 方法学考察[4～6]

2.3.1 准确度试验 供试品溶液的制备：蚓激酶干粉（批号18100005-2）取10 mg，精密称定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀备用。精密量取供试品溶液0.25 ml 具塞试管中，分别精密加入对照品溶液0.25 ml、0.35 ml、0.40 ml，加磷酸盐缓冲溶液（pH值6.8）至1 ml，作为供试品Ⅰ组（80%）、供试品Ⅱ组（100%）、供试品Ⅲ组（120%）。依法测定吸收度，各重复测定3 次。另取磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）依法测定，作为空白。结果供试品Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组平均回收率为99.2%，RSD 为0.38%，准确度试验符合测定要求。见表2。

表2 准确度试验结果

2.3.2 重复性试验 供试品溶液的制备：蚓激酶干粉（批号：18100005-2）取10 mg，精密称定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀备用，作为供试品溶液。取供试品溶液依法测定吸收度，重复测定6 次。另取磷酸盐缓冲溶液（pH 值6.8）作为空白，依法测定。6 次测定的平均吸收度为0.785，RSD 为0.47%，重复性试验符合规定。见表3。

表3 重复性试验结果

2.4 样品效价测定结果 取蚓激酶干粉、30 万蚓激酶肠溶胶囊与60 万蚓激酶肠溶胶囊各3 批，按照2.2.4 中方法制备供试品溶液，避光与传统生物平板法测定结果比较，结果相近。见表4。

表4 样品效价测定结果

3 讨论

本研究中，进行光谱扫描所用的蚓激酶标准溶液浓度为4 300 U/ml，其吸光度仅为0.165，吸光度太低。同时供试品溶液稀释1 000 倍，导致吸光度太低，误差大。效价结果重现性不好，所以该方法不适用，需调整标准品及供试品溶液浓度，在后续的实验中我们进行了调整。

本研究建立的紫外分光光度法测定蚓激酶效价方法，条件易控制，操作较简便迅速，试剂成本较低，方法准确。效价结果与生物平板法测定效价结果相近。因此，本方法适用于蚓激酶及肠溶胶囊的效价测定。