PPARγ激动剂对COPD大鼠炎症及血管重塑指标的影响

王 琛， 李 智， 谭 林

青岛大学附属青岛市市立医院重症医学科，青岛 266071

根据最新的《全球疾病负担》报告，目前所有非传染性慢性肺部疾病加在一起构成全球非传染性疾病的第3大死因，其中2016年慢性阻塞性肺疾病(COPD)造成230万人死亡[1]。在COPD中，肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)的患病率与病情的严重程度密切相关，多达90%的患者静息平均肺动脉压(mPAP)超过20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。约有1%的COPD患者患有严重的PH，mPAP值在35～40 mmHg，PH在COPD中的存在和严重程度对患者生存率有重要影响。缺氧引发的肺血管收缩是PH的主要致病机制，持续的血管收缩导致肺血管结构的变化，主要影响肺小动脉。在COPD中，炎症、低氧、烟草烟雾的暴露导致血管重塑、肺血流动力学改变[2]。

过氧化物酶增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)的激动剂罗格列酮在COPD患者中给药时可抑制香烟烟雾诱导的支气管上皮细胞炎症因子、趋化因子和活性氧类(reactive oxygen species,ROS)等的产生，且罗格列酮可剂量依赖性地抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)产生，PPARγ参与COPD的气道炎症过程[3]，但针对其在COPD患者炎症因子白介素-8(IL-8)的产生和肺动脉的血管重塑的作用研究尚少。肺小动脉血管的重塑是导致PH的主要原因，目前COPD合并PH患者的治疗仍以针对诱因治疗为主，临床治疗效果不佳，个体化差异较大。为此，本研究拟探讨盐酸罗格列酮调控PPARγ转录水平对COPD大鼠炎症因子的产生和肺小动脉血管重塑的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 雄性Wistar大鼠36只，购自青岛市药物检验检疫所，6～8周龄，体质量180～220 g，SPF级饲养。试剂：哈德门(山东中烟工业有限责任公司，中国)；盐酸罗格列酮(文迪雅，4 mg/片)；LPS(美国Sigma公司)；大鼠白介素-8(IL-8) ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；TRIzol试剂、M-MuLV一步法RT-PCR试剂盒、引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。主要仪器：自制烟熏箱和低氧仓。低氧仓大小约54 cm×30 cm×32 cm，钻5个直径3 cm孔，使仓内保持常压，并往仓内注入氮气调节氧浓度，使氧体积分数维持在0.1左右。

1.2 动物分组及处理 将大鼠按数字法随机分为药物治疗组(A组)、非药物治疗组(B组)和空白对照组(C组)，每组12只。A组参照钟小宁等[4]方法制作COPD肺动脉高压大鼠模型，B组与A组相似，但第3周开始每只大鼠每天给予盐酸罗格列酮1 mg治疗；C组给予相同体积生理盐水模拟造模，正常饲养。

1.3 组织学检查 以100 g/L水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，打开胸腔，取双肺分别置于-70℃冰箱和40 g/L中性甲醛中保存备用。肺组织以40 g/L中性甲醛固定后，常规脱水包埋，并进行苏木精-伊红染色。每只大鼠肺组织切片随机选择5个视野，按照文献[5]的方法观测直径50～100 μm的腺泡内肌化型小动脉的血管壁面积、血管总面积，并计算血管壁面积/血管总面积(MA%)比值。

1.4 IL-8检测 准备好标准品并用洗涤缓冲液1∶1稀释于反应孔内，后取大鼠肺组织50 mg，加入适量生理盐水捣碎，离心10 min后取待测样品上清液50 μL置于反应孔内，立即加入50 μL生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1 h，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，震荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次后，每孔加入80 μL的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min；甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次后，每孔加入底物A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37℃温育10 min，避免光照，取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后立即在450 nm波长处测定各孔的光密度(D)值，以D值为纵坐标，相应的待测物质浓度为横坐标，绘制相应曲线，并根据其D值由标准曲线换算出相应浓度。

1.5 RT-PCR检测PPAR mRNA的转录水平 取肺组织50 mg，加入0.5 mL TRIzol提取总RNA，测定RNA浓度。取1 μL mRNA产物按照一步法反转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为模板行PCR扩增。引物通过Primer Premier5软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。PPAR上游引物序列为5′-T CTCT CCGTAAT GGAAGACC-3′，下游引物序列为5′-GCAT TAT GA GACAT CCCCAC-3′；actin上游引物序列为5′-AGCCAT GTAGCCA TCC-3′，下游引物序列为5′-AGCCAT GTAGCCA TCC-3′。将PT-PCR产物在12 g/L的琼脂糖凝胶中电泳(100 V)30 min，在紫外灯下检测目的条带电泳情况，应用Scion image软件对电泳条带进行吸光度扫描，以面积吸光度表示条带的丰度，以此作为mRNA表达的强度，以actin作为内参照，PPARγ mRNA的相对表达水平采用PPARγ/actin计算得出。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计处理。组间死亡率比较采用Fisher确切概率法，PPARγ转录水平、MA%与IL-8值多组间比较采用单因素方差分析LSD法，组间相关性分析采用Pearson相关性分析，检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 存活率分析 A组有2只大鼠分别在第5、6周死亡；B组、C组大鼠无死亡。因样本量<40，所以采用Fisher确切概率法进行计算。A组大鼠存活率低于C组，组间差异无统计学意义(Fisher值=3.856,P=0.167)。

2.2 血管壁病理改变 病理切片结果(图1)示：A组大鼠血管壁周围中性粒细胞增多，即淋巴细胞形成，管壁平滑肌层增厚，其外观可见大量胶原沉积。C组大鼠血管壁周围无明显炎性细胞浸润，血管壁平滑肌层未见增厚，无胶原沉积。B组血管壁重塑及炎性浸润情况较A组减轻，但仍较C组严重。病理切片由经验丰富的病理科医师双盲读片。光镜下病理评分基于以下变量：肺小动脉周围中性粒细胞浸润、血管平滑肌层增厚程度。严重程度评分：无损伤=1分(无病理改变)；轻度损伤=2分(有中性粒细胞浸润，且血管壁轻度增厚)；重度损伤=3分(大量中性粒细胞浸润且血管壁明显增厚)。每个样本有5个切片，被随机分析，以平均值作为样本的最终评分。结果见图1。

图1 大鼠肺组织病理切片评分

2.3 肺小动脉血管重塑比较 对直径50～100 μm肌化性动脉进行分析，结果(表1)显示：A组、B组、C组间MA%差异具有统计学意义(F=47.84,P<0.01)，A组MA%较C组明显升高，B组MA%较A组明显下降(P均<0.05)。

2.4 IL-8检测指标比较 结果(表1)表明：A组、B组、C组之间IL-8差异具有统计学意义(F=47.87,P<0.01)，A组明显高于B组，B组高于C组(P均<0.05)。

表1 A、B、C组MA%和IL-8比较

2.5 肺组织PPARγ转录水平比较 结果(图2)表明：A、B、C组之间差异具有统计学意义(F=96.39,P<0.01)，C组、B组、A组PPARγ/actin指标逐渐下降，A组明显高于B组，B组高于C组(P均<0.05)。

图2 3组PPARγ/actin水平比较

2.6 PPARγ转录水平与MA%、IL-8值的相关性 B组大鼠中PPARγ转录水平与MA%负相关(r=-0.662,P<0.05)，与IL-8值负相关(r=-0.615,P<0.05)，而B组中MA%与IL-8正相关(r=0.980,P<0.05)。

3 讨 论

COPD是感染引起的、进行性气道炎症，慢性气道炎症在COPD中起主要作用，可引起杯状细胞增加、黏液腺增生、肉芽肿和肺气肿，导致巨噬细胞激活并释放TNF-α、IL-6、IL-8、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、白三烯B-4和ROS等炎症介质和趋化因子。目前气道上皮细胞已被证实可分泌IL-8，引起小气道纤维化进展，是COPD的炎性标志物。另有国外研究[6]表明，IL-8是使中性粒细胞聚集的主要细胞因子，其也被认为是COPD发展的关键因素。香烟烟雾足以刺激COPD气道中IL-8的过度释放，且在COPD急性加重期时，中性粒细胞和循环中的IL-8可在气道中大量聚集。

在COPD慢性炎症的损伤与修复过程中，肺小动脉血管平滑肌的增殖和血管壁周围大量的胶原沉积共同参与了肺血管壁结构的重建[7-8]。目前作为PPARγ激动剂的噻唑烷二酮(TZD)，其与糖皮质激素受体相似，是具有抗氧化作用的核激素受体超家族成员之一，通过多种机制发挥有效的抗氧化和抗炎作用，包括下调NF-κB和其他促炎转录因子[3]，虽然其主要作为新型胰岛素增敏剂，被广泛用于2型糖尿病的治疗，但也在多种肺细胞类型中普遍表达，包括肺血管内皮细胞和平滑肌细胞。在实验性肺高压动物模型(主要通过低氧诱导肺高压)中，肺和肺小动脉中的PPARγ表达下调，导致发展为PH，这提示PPARγ在PH中具有保护作用。PPARγ激动剂TZD药物罗格列酮激活PPARγ是对抗PH的有前途治疗剂，可以保护肺小动脉，部分原因是可以通过抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移而实现该作用[9]。

本研究主要探讨PPARγ激动剂是否在低氧、烟熏、LPS诱导下的COPD大鼠肺组织中有抑制促炎因子IL-8的生成和改善血管重塑的作用。病理切片显示，B组肺血管壁重塑及其周围的中性粒细胞浸润较A组减轻，但仍较C组严重；相关实验结果显示，A组、B组大鼠的MA%比值、IL-8均高于C组，A组大鼠明显高于B组。A、B、C组肺组织内PPARγ的转录水平依次递增，B组大鼠PPARγ转录水平与MA%比值、IL-8均负相关。以上结果说明PPARγ激动剂罗格列酮可以抑制肺血管平滑肌细胞的增殖、抑制血管结构重塑、抑制促炎因子IL-8生成，抑制IL-8的生成可能抑制了肺血管周围中性粒细胞的浸润，而肺部炎症是COPD进展的核心机制[10]，那么本研究表明，罗格列酮可能是通过抑制其血管周围的炎症、中性粒细胞的浸润，从而抑制血管壁的重塑和胶原蛋白的沉积，但是其中的具体生物学机制如何尚不清楚，这为进一步的研究提供了方向。

综上所述，罗格列酮在COPD大鼠中可通过激活PPARγ而有效抑制IL-8的生成，从而抑制肺血管壁平滑肌细胞的增殖和胶原蛋白的沉积，这为罗格列酮治疗COPD肺高压提供了一定的理论支持，为临床探索治疗肺高压的新型药物提供了新思路。