miR-1915-3p在胃癌细胞中的表达水平及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

王 娟 张 婕 纪孝联

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，是全球癌症死亡的主要原因，每年因胃癌死亡的患者占所有癌症死亡人数的10%[1-3]。尽管手术、放化疗等治疗在日趋完善，但复发和转移仍是胃癌治疗失败的主要原因。因此，确定胃癌发生和发展的关键因素和其潜在的分子机制，对胃癌的诊断和治疗均能起到至关重要的作用。大量研究[4-6]显示，癌症中miRNA的异常表达，可作为生物标记物用于早期诊断或靶向治疗。在miRNA的表达谱中已确定有29个miRNA在胃癌中表达异常，如miR-338-5p、miR-1915-3p和miR-3178等[7]。肿瘤中miRNA的异常表达常与凋亡相关基因有关，相关研究[8-10]等在结直肠癌中报道miR-1915可通过靶向调节Bcl-2的表达介导多重耐药机制。本文拟探讨miR-1915-3p在胃癌中的表达水平及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，以期为胃癌的诊断或治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 永生化胃上皮细胞GES-1，人胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和MKN-45均购于上海细胞生物学研究所；RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、噻唑蓝粉末、和显影剂等购于北京鼎国有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和lipofeetamine 2000购于日本TaKaRa公司；anti-Bcl-2、anti-β-actin和辣根过氧化物酶标记的二抗均购于Cell Signal公司；miR-1915-3p和miR-NC质粒由广州锐博生物有限公司合成；BCA蛋白定量试剂盒购于江苏碧云天有限公司；凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 永生化胃上皮细胞GES-1及人胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和MKN-45用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。放置37℃含有5% CO2的恒温箱中，当细胞密度长至80%～90%时，用0.25%胰酶-EDTA消化，放入离心机中1 000 r/min，运行5 min。用新鲜培养液重悬细胞，吸取1/3细胞接种至新的培养皿中继续培养。

1.3 转染实验 利用转染技术将miR-1915-3p质粒和对照质粒(miR-NC)转染至MGC-803、SGC-7901细胞中，分别设置为MGC-803细胞miR-1915-3p组和miR-NC组，SGC-7901细胞miR-1915-3p组和miR-NC组。胰酶消化MGC-803和SGC-7901细胞，并吹散成为单个悬浮细胞，离心洗涤后用无血清培养基(Serum-Free Medium，SFM)1640培养基重悬，在每孔含有440 μL SFM培养基的24孔板中接种约2×105个/孔的细胞；将5 μL浓度为20 μmol/L的miR-1915-3p和miR-NC加入到50 μL lopti-MEM中，轻轻混匀，室温孵育5 min；在上述混合液中加入5 μL转染试剂lipofeetamine 2000，轻轻吹打混匀，室温孵育15 min；将60 μL转染试剂抑制物混合试剂加入含有细胞的孔板中，轻轻混匀，miR-1915-3p和miR-NC的转染终浓度为100 nmoL/L；将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h后，利用qRT-PCR实验检测MGC-803、SGC-7901细胞转染miR-1915-3p和miR-NC质粒后miR-1915-3p的相对表达水平,重复3次，评估转染效率。

1.4 细胞增殖实验 采用细胞增殖实验检测miR-1915-3p组和miR-NC组细胞的OD值。将转染过的细胞以每孔3×103的密度接种于96孔板中，分别设置的培养检测时间为12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，每个检测时间点设置6个平行孔，20 μL 噻唑蓝溶液加入检测孔中，继续孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，震荡5 min然后用酶标仪检测570 nm处每个孔的OD值(活细胞的数量与OD值成正比)，重复3次并进行组间比较。

1.5 qRT-PCR实验 检测不同组中miR-1915-3p的相对表达水平，收集细胞样品根据试剂盒说明书提取细胞中的总RNA，反转录为cDNA。引物设计如下：miR-1915-3p上游引物序列5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游引物序列5′-TGCTTAACCCCTCA CCTTGA-3′ ，U6上游引物序列5′-CGCGAGAAGATGACCCAGATC -3′ ，下游引物序列5′- TGGTACGGCCAGAGGCG-3′。每种基因的表达变化用2-ΔΔCt法计算，以管家基因U6的mRNA水平作为内参，重复3次计算不同组中miR-1915-3p的相对表达水平。

1.6 凋亡实验 采用Annexin V-FITC和PI双染法检测miR-1915-3p组和miR-NC组细胞的凋亡率。细胞以4×105的密度接种于6孔板中，培养48 h以后收集细胞，分别加入390 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，室温避光，在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，重复3次。右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，凋亡率=[(右下象限细胞数+右上象限细胞数)/总细胞数]×100%。

1.7 Western blot实验 检测miR-1915-3p组和miR-NC组细胞中Bcl-2蛋白表达情况。收集细胞提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒定取30 μg蛋白。制作10%的分离胶和5%的浓缩胶，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将蛋白转至PVDF膜上。根据maker和目的蛋白分子量大小切取适当大小的膜，用5%脱脂奶粉封闭、一抗(1∶1 000)过夜孵育、TBST溶液清洗、二抗(1∶4 000)室温孵育1 h、TBST溶液清洗。配置一定量的显影液，均匀滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝胶成像系统中拍照。采用ImageJ软件对蛋白条带进行定量分析，以β-actin为内参，重复3次比较不同组间Bcl-2蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 miR-1915-3p在胃癌细胞中的表达水平 miR-1915-3p在MGC-803、SGC-7901和MKN-45中的相对表达水平分别为(0.46±0.06)、(0.42±0.06)和(0.33±0.04)，均低于GES-1细胞(1.00±0.12)(t=13.817、14.902、17.035，P<0.05)。见图1A。miR-1915-3p和miR-NC质粒转染至在MGC-803和SGC-7901细胞后，qRT-PCR检测结果显示，在MGC-803细胞中，miR-1915-3p组miR-1915-3p相对表达水平为(1.85±0.19)，高于miR-NC组的(1.00±0.05)，差异有统计学意义(t=7.465，P=0.002)。见图1B。在SGC-7901细胞中，miR-1915-3p组miR-1915-3p的相对表达水平为(1.74±0.10)，高于miR-NC组的(1.00±0.04)，差异有统计学意义(t=12.063，P<0.001)。见图1C。

图1 不同组间miR-1915-3p表达水平比较

2.2 miR-1915-3p组与miR-NC组OD值比较 在MGC-803细胞中，miR-1915-3p组细胞培养72 h的OD值为(0.67±0.07)，低于miR-NC组的(1.24±0.09)，差异有统计学意义(t=5.214，P<0.001)。在SGC-7901细胞中，miR-1915-3p组细胞培养72 h的OD值为(0.56±0.07)，低于miR-NC组的(0.92±0.08)，差异有统计学意义(t=3.041，P=0.008)。见图2。

图2 miR-1915-3p组与miR-NC组OD值比较

2.3 miR-1915-3p组与miR-NC组细胞凋亡率比较 MGC-803细胞中，miR-1915-3p组细胞凋亡率为(23.4±5.6)%，高于miR-NC组的(6.7±1.2)%，差异有统计学意义(t=6.519，P=0.003)。SGC-7901细胞中，miR-1915-3p组细胞凋亡率为(34.7±10.2)%，高于miR-NC组的(7.2±1.5)%，差异有统计学意义(t=9.684，P<0.001)。见图3。

图3 miR-1915-3p组与miR-NC组细胞凋亡率比较

2.4 miR-1915-3p组与miR-NC组Bcl-2蛋白表达比较 在MGC-803细胞中，miR-1915-3p组Bcl-2蛋白灰度值为(0.32±0.06)，低于miR-NC组的(0.86±0.12)，差异有统计学意义(t=8.325，P<0.001)。在SGC-7901细胞中，miR-1915-3p组Bcl-2蛋白灰度值为(0.18±0.08)，低于miR-NC组的(0.76±0.10)，差异有统计学意义(t=7.214，P<0.001)。见图4。

图4 miR-1915-3p组与miR-NC组Bcl-2蛋白表达比较

3 讨论

近几年，虽然治疗胃癌的手术和放化疗效果有所提升，但胃癌患者的5年生存率仍停留在20%左右[11]。分子靶向治疗通过抑制肿瘤细胞的增殖和促进细胞凋亡在癌症的治疗中具有广阔前景。非编码RNA的生物功能在逐渐的被发现，包括miRNA，lncRNA，circRNA等。miRNA在癌症中发挥重要作用，可调节癌细胞的增殖、分化、凋亡和其他生物学功能[12]。miRNA的表达失调与癌症的发生发展以及药物的抵抗作用有关[13]。miR-1915-3p可作为肾脏损伤的标记物，用于评估糖尿病肾病和系统性红斑狼疮患者的肾脏损伤情况[14]，miR-1915和miR-1225-5p对肾干细胞和肾祖细胞有一定的调节功能[14]，miR-1915在结直肠癌的多重耐药中发挥一定作用[10]，miR-1915-3p在骨髓间质中的表达与细胞增殖和衰老有关[15]。细胞凋亡是一种受内在基因调控的细胞主动程序化死亡过程，是机体维持稳定的重要调节机制，细胞凋亡不足会引发癌症。Bcl-2是抗细胞凋亡基因，通过介导细胞膜的通透性来抑制细胞色素C等促凋亡蛋白的释放，阻止细胞凋亡的级联反应，其表达下调可使肿瘤细胞凋亡率明显增加。

本研究选取三种胃癌细胞系和一种永生化胃上皮细胞进行研究，结果显示在三种胃癌细胞系中，miR-1915-3p的表达水平显著低于永生化胃上皮细胞(P<0.05)。为进一步研究miR-1915-3p在胃癌中的作用机制，本研究将miR-1915-3p质粒转染至胃癌细胞中检测其对细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，miR-1915-3p组胃癌细胞的增殖能力减弱，凋亡率显著增加，miR-NC组胃癌细胞增殖能力强，凋亡率低，以上结果表明胃癌细胞中miR-1915-3p的表达水平降低，可能参与了胃癌的进展。Western blot结果显示，miR-1915-3p组Bcl-2蛋白的表达明显减弱，Bcl-2基因是一种癌基因，它具有抑制凋亡的作用，近年来相关研究已开始揭示这一作用的机制。在本研究中，胃癌细胞中miR-1915-3p表达水平降低，Bcl-2蛋白的表达水平较高，进一步抑制胃癌细胞的凋亡，促进增殖，这可能是miR-1915-3p参与胃癌发生进展的作用机制之一。Cui等[16]研究显示，miR-1915-3p在胃癌细胞中的表达水平降低，参与胃癌的发生发展，可能成为胃癌治疗的有效靶点之一，本研究与Cui等研究有相似之处。本研究还存在一定不足，仅针对胃癌细胞进行研究，在胃癌组织中及癌旁组织中，miR-1915-3p的表达却没有涉及。在后续的研究中，笔者将集中研究胃癌组织中miR-1915-3p的表达水平，及其对患者临床病理特征的相关性和生存率的影响。

综上所述，miR-1915-3p在胃癌细胞中表达水平降低，上调miR-1915-3p的表达可抑制胃癌细胞增殖，其可能机制为抑制Bcl-2蛋白的表达以促进胃癌细胞凋亡，这可能是胃癌发生和发展的作用机制之一。