表没食子儿茶素没食子酸脂联合阿米福汀对小鼠卵巢的辐射保护作用

李孝鹏 王章桂 魏 南

2018年世界肿瘤统计数据表明：全世界新发肿瘤人数为1 810万，死亡人数为960万[1]，放疗是肿瘤主要治疗手段之一，放射线对肿瘤周围正常组织损伤是引起放疗副反应的重要基础，阿米福汀(amifostine,WR-2721)作为辐射保护剂，具有清除自由基、转移氢离子和稳定DNA的作用，放疗前15分钟使用WR-2721，可以降低放射线引起的肿瘤周围正常组织损伤[2]。表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶的主要活性成分，具有清除自由基，降低辐射引起的正常组织损伤，提高肿瘤细胞对放射线的敏感性[3]。卵巢对放射线非常敏感，即使接受<2 Gy X线照射，也会导致50%的卵母细胞结构破坏，6 Gy X线照射可引起30岁女性卵巢中度功能障碍，随着照射剂量的继续增加，可引起急性卵巢功能衰竭、不孕、绝经[4]，绝经前妇女放疗时，须注意卵巢的辐射保护。本研究探讨EGCG在辐射引起的小鼠卵巢损伤中的作用，明确联合WR-2721在辐射损伤中的意义，为探索新型辐射保护剂提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雌性SPF级6～8周ICR小鼠150只，购自安徽医科大学动物中心，动物许可证号：SYXK(皖)2017-0012],体质量24.12～31.77 g，平均(28.07±2.02)g，饲养室温度20℃，相对湿度50%，充足的食物及水供应。

1.1.2 药品及试剂 EGCG(每瓶0.5 g，批号E8307，南京道斯夫生物技术有限公司)；WR-2721(每瓶0.4 g，批号H20010403，大连美罗大药厂)；注射用孕马血清促性腺激素(每瓶1 000 IU，批号 S160907，宁波三生药业有限公司)；TUNLE试剂盒(瑞士Roche公司)。

1.1.3 仪器 Precise直线加速器(瑞典医科达公司)；BC-5300血细胞分析仪(深圳迈瑞公司)；DMD108显微镜(德国徕卡公司)；BT25S分析天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 动物分组、模型建立及标本采集

1.2.1 动物分组 小鼠编号后，按照随机数字法分为Sham组(不接受辐射)、Control组(接受辐射，不接受WR-2721或EGCG治疗)、WR组(接受辐射和WR-2721治疗)、EGCC组(接受辐射和EGCG治疗)和WR+EGCG组(接受辐射以及WR-2721和EGCG联合治疗)，每组30只。

1.2.2 模型建立 辐射前48小时，所有小鼠腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素，统一动情周期；辐射前2小时，将EGCG(40 mg/kg)经口服给药方式给相应组别的小鼠；辐射前15分钟，将WR-2721 (300 mg/kg)经腹腔注射方式给相应组别的小鼠；辐射方法：小鼠固定在特制的盒子内接受6 Gy X线照射，剂量率为600 cGy/min，放射源到小鼠的距离为100 cm。

1.2.3 标本采集 辐射后第8小时、第3、7、10、14天测小鼠体质量，第8小时、第7天和第14天处死小鼠，每次每组10只小鼠禁食、禁水6 h，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg),麻醉后摘除眼球取20 μL的血液，放入含EDTA-K2抗凝剂的离心管；取小鼠双侧卵巢，称重后，一侧置于4%甲醛溶液中，另一侧置于RNA保护液中，计算卵巢指数[卵巢指数=卵巢质量(g)/小鼠体质量(g)×100%]。

1.3 观测指标及测定方法

1.3.1 一般情况观察 每2天称小鼠体质量1次，观察并记录其体质量变化、饮食情况、毛色、精神状态等。

1.3.2 血细胞测定 用血细胞分析仪测定各组小鼠白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板计数。

1.3.3 卵巢病理学检查 小鼠卵巢经4%甲醛溶液充分固定后，分别以70%、80%、90%、95%、100%浓度的乙醇对组织进行脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片后，将切片放在二甲苯中脱蜡20 min，然后在100%、95%、90%和80%乙醇各浸1 min，HE染色。在光学显微镜下，观察卵巢组织的病理形态学变化。

1.3.4 细胞凋亡及凋亡指数检测 采用TUNEL细胞凋亡试剂盒检测卵巢细胞凋亡,每组随机选取3只小鼠，共200个卵泡，卵泡中30%的颗粒细胞染色呈阳性时，判定该卵泡凋亡[5]。凋亡指数为卵泡中染色阳性颗粒细胞数占颗粒细胞总数的百分比。

2 结果

2.1 辐射后体质量和血象变化 小鼠体质量存在组别和时间点的交互作用，Control组小鼠辐射后第7天，体质量显著下降，后缓慢恢复。Sham组小鼠体质量持续增长，WR、EGCG、WR+EGCG组小鼠辐射后，体质量缓慢上升，不同时间点测量小鼠体质量差异有统计学意义(P<0.05)；WR、EGCG组小鼠体质量与Control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，WR+EGCG组与Control组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 5组小鼠不同时间点体质量比较

小鼠白细胞、红细胞存在组别和时间点的交互作用，与Sham组比较，辐射后小鼠白细胞数均降低,Control组下降幅度最显著(P<0.05)，见表2；辐射后第14天，WR、EGCG、WR+EGCG组红细胞数均高于Control组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3；各组血红蛋白水平辐射后变化不大，见表4；辐射后第7天，与WR+EGCG组相比，Control组小鼠血小板计数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表2 5组小鼠白细胞变化比较

表3 5组小鼠红细胞变化比较

表4 5组小鼠血红蛋白比较

表5 5组小鼠血小板比较

2.2 卵巢形态及卵巢指数变化 辐射后8小时，Sham组、Control组和WR+EGCG组卵泡形态无明显差异。辐射后第7、14天，与Sham组相比，Control组的卵泡平均数量明显减少，出现大量闭锁卵泡或空卵泡，WR、EGCG组存在少量的闭锁卵泡或空卵泡，而WR+EGCG组未见闭锁卵泡或空卵泡。见图1。

图1 辐射后小鼠卵巢组织形态学比较(指向三级卵泡,表示闭锁卵泡,CL为黄体)(HE,×40)

小鼠卵巢指数存在组别和时间点的交互作用，进一步按时间点分层比较，辐射后8小时，5组小鼠的卵巢指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。辐射后第7天，与Sham组及WR+EGCG组相比，Control组小鼠卵巢指数显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，WR、EGCG及WR+EGCG组小鼠卵巢指数轻度下降，且3组之间差异无统计学意义(P>0.05)。辐射后第14天，EGCG组及WR+EGCG组小鼠卵巢指数高于Control组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 5组小鼠卵巢指数比较

2.3 卵巢细胞凋亡变化 所有组别中，Control组TUNEL染色阳性的闭锁卵泡及凋亡颗粒细胞最多。见图2。卵巢颗粒细胞凋亡指数存在组别和时间点的交互作用，与Sham组比较，接受辐射的卵巢颗粒细胞凋亡指数均升高，Control组最高,EGCG组和WR组凋亡指数升高介于Control组及WR+EGCG组之间，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

图2 卵巢组织阳性细胞核呈棕黄色，固缩成团或聚成环状，或碎裂，形成凋亡小体(IHC,×100)

表7 5组小鼠卵巢凋亡指数比较

3 讨论

既往研究[5-6]表明接受大剂量辐射后，小鼠出现烦躁不安，反应迟钝，饮食量下降，体质量减轻等改变。骨髓及造血系统严重破坏，表现为骨髓细胞大量死亡，有核细胞及造血干细胞急剧减少，外周血细胞减少，尤其是白细胞，对血小板及红细胞影响稍小。本研究结果显示，接受辐射后第7天，Control组小鼠体质量降至最低点，后缓慢恢复，WR、EGCG及WR+EGCG组小鼠体质量未见降低，但增长幅度变缓，辐射对WR+EGCG组小鼠体质量影响最小。辐射可致外周血中白细胞降低，对血小板、红细胞及血红蛋白影响较小，WR-2721和EGCG能降低辐射后外周血细胞计数下降程度，联合用药对外周血细胞保护作用更显著。因此，EGCG联合WR-2721可预防小鼠辐射后体质量下降，降低放射线对骨髓的损伤，维持血细胞水平。

卵巢由卵母细胞和颗粒细胞组成，颗粒细胞围绕着卵母细胞形成一个功能性的卵泡单元，颗粒细胞与卵母细胞的双向调节促进卵泡发育成熟。动物实验表明，卵巢极易受到辐射损伤，电离辐射暴露后数小时，分裂的颗粒细胞功能最早受到影响，颗粒细胞和卵母细胞之间双向调节减少，卵泡发育受到损伤，导致卵巢早衰和不孕，卵母细胞的遗传DNA也可能被破坏，并传递给子代。不同发育阶段的卵母细胞对辐射损伤的敏感性不同，静止的原始卵泡抗辐射能力最强，成熟的窦状卵泡对辐射最敏感。辐射还会引起卵巢血管基质萎缩和纤维化，最终导致卵母细胞死亡和卵泡闭锁[7-9]。本研究中，小鼠接受辐射后，不同发育阶段的卵泡显示出明显的变形，晚期闭锁卵泡颗粒层附近空腔内可见核固缩和凋亡细胞碎片，闭锁卵泡数量显著增加。辐射后第7天，小鼠卵巢凋亡颗粒细胞数量多于第8小时的数量，具有闭锁特征。Control组小鼠卵巢凋亡指数升高，WR、EGCG及WR+EGCG组凋亡指数也升高，但均低于对照组，尤其是WR+EGCG组。Control组小鼠卵巢指数下降，WR、EGCG及WR+EGCG组卵巢指数轻度下降，WR+EGCG组小鼠指数下降幅度最低。因此，WR-2721、EGCG可协同逆转辐射引起的颗粒细胞凋亡作用。

WR-2721进入体内后生成具有活性的硫醇自由基和WR-1065，可清除放疗过程中组织产生的自由基，以P53依赖的方式保护细胞免受细胞毒效应，与DNA核蛋白结合后，改变染色体核小体间的结构，降低细胞凋亡。WR-2721半衰期约30 min，部分患者使用后，可出现为头晕、恶心、呕吐、乏力等症状[10]。EGCG使用方便且基本没有副反应，Ⅱ～Ⅲ期临床研究[3,11]表明，肺癌、食管癌放化疗期间每日口服EGCG能明显降低放射性食管炎发生率，且服用时间越早，效果越好，对出现的放射性食管炎治疗效果确切。放射性食管炎作用机制可能为：①EGCG能降低血清丙二醛水平，提高血清总超氧化物歧化酶活力，上调Nrf2-ARE信号途径增加抗氧化酶表达，提高机体抗氧化能力[12]；②放疗引起组织DNA Rad23b和Ddit3启动子高甲基化和表达降低来逆转辐射损伤[13]；③通过清除过多的活性氧或促进已发生转化的异常细胞的凋亡。

综上所述，EGCG可以降低辐射后卵巢颗粒细胞凋亡，减少卵巢闭锁，保护卵巢形态与功能，作用机制与WR-2721不同，两者联合使用对辐射后的卵巢保护作用更显著，且EGCG为绿茶提取物，安全性更高。