纳豆激酶在血管性疾病防治中的研究进展

刘玉猛 刘英华

摘 要：综述了纳豆激酶的生化特性、防治心血管疾病的功效及应用前景，重点阐述了纳豆激酶在心血管疾病方面的药理作用，表明纳豆激酶可以作为预防和治疗血管性疾病的膳食补充剂，其作为药品的开发前景广阔。

关键词：纳豆激酶;血管性疾病;溶栓

对于血栓栓塞性疾病，目前临床上主要是溶栓治疗，常用的一些溶栓药物为链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）等，但这些药物均不同程度存在副作用大、毒性强、半衰期短、使用不便、价格昂贵等不足。近年来研究发现，纳豆激酶（NK）作为食品或膳食补充剂，具有强烈的溶栓活性，且安全性较高，可作为一种新型溶栓剂研究和开发。本文综述NK的生化特征、在血管性疾病中的功效及应用的研究进展。

1 纳豆激酶的生化特性

NK是一种碱性丝氨酸蛋白酶。20世纪80年代日本学者Sumi首次发现，纳豆发酵过程中形成的纳豆菌丝提取物对人工血栓具有溶解作用，并确定其为纳豆芽孢杆菌分泌的一种酶，命名为NK[1]。NK氨基酸序列与其他枯草杆菌蛋白酶高度同源，且具有底物专一性，对血浆纤溶酶底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-PNA）最为敏感，对凝血酶底物S-2238（H-d-Phe-Pie-Pip-Arg-pNA）和激肽释放酶底物S-2302（H-D-Pro-Phe-Arg-pNA）也有一定活性，而对于尿激酶底物S-2444（pyro-Glu-Gly-ArgPNA）和弹性蛋白酶底物S-2484（pyro-Glu-Pro-Val-PNA）没有作用，由此可见NK在水解蛋白质上具有特异性[2]。

影响NK稳定性的因素很多，包括温度、pH、金属离子和有机化合物等。NK在45 ℃时活性较为稳定，高于45 ℃活性明显下降，55 ℃时活性完全丧失;NK活性几乎不受低温影响，反复冻融5个循环以后，酶活性仍能保持95%以上。pH值在6.0～9.0之间NK较为稳定，低于5.0时稳定性较差，其最适pH为7.0[3]。目前已经可以通过基因工程技术改善NK的热稳定性和pH值耐受性，通过点突变技术获得的重组NK双突变体Q59E/N218D热稳定性明显提高，酶活性保持不变;用酸性或碱性氨基酸替换纳豆激酶Ser182和Leu203位点则可以改变重组NK的最适pH值，使其在酸性范围或碱性范围内保持稳定。NK的活性不受5 mmol/L Cys的影响，乙二胺四乙酸（EDTA）对其有轻微的抑制作用，而蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）能完全抑制其活性[4-5]。金属离子对于NK活性影响各异：Mn2+和Ca2+具有明显NK激活作用，金属离子Hg2+和Cu2+可使其完全失活，Zn2+和Al3+对NK有一定抑制作用，K+和Fe2+则对NK无明显影响[6]。

2 纳豆激酶防治血管性疾病的功效

2.1 预防血栓形成及溶栓作用

机体内纤溶系统功能降低是血栓形成的重要原因之一，而血液的纤溶能力主要取决于血浆t-PA及纤溶酶原激活剂抑制因子-1（PAI-1）的活性[7]。研究发现，NK可以从多方面发挥预防血栓及溶栓作用。

2.1.1 NK具有较强的纖维蛋白溶解活性 NK溶栓的效果要远大于纤溶酶和弹性蛋白酶，活性是纤溶酶的4倍。NK能够水解纤维蛋白成多肽和氨基酸，体外实验证明，把NK提取液加到纤维蛋白平板上时，随即出现透明溶解环，溶解环的大小和酶的活性正相关，溶栓效果显著[8]。动物实验表明，NK在体内发生纤溶作用时，不用通过激活纤溶酶原，而是直接水解交联纤维蛋白。其对交联纤维蛋白水解活性很强，对纤维蛋白原不敏感，即不会水解血浆中的纤维蛋白原而造成出血倾向。

2.1.2 NK能激活其他纤溶酶尿激酶原和t-PA等 NK能激活尿激酶原使之转变为尿激酶，间接增强内源性纤溶酶量及活性[9]，作用机理可能为：（1）刺激血管内皮细胞产生t-PA，t-PA将纤溶酶原激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白、降解血栓[10];（2）激活体内的尿激酶原转化为尿激酶，尿激酶与t-PA共同激活纤溶酶原，发挥溶栓效果;（3）降解和失活纤溶酶原激活物抑制剂PAI-1，间接增加尿激酶和t-PA的量，促进血纤维蛋白的溶解。

2.1.3 NK具有一定的抗血小板聚集作用 有研究通过观察NK对急性血瘀模型大鼠血液流变学和血小板聚集的影响，发现其能明显降低血瘀大鼠的全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数等血液流变学指标水平，同时由ADP、凝血酶、花生四烯酸诱导的血小板聚集也被明显抑制[11]。人血小板Ca2+动员的体外实验表明，其抗血小板聚集作用的机制可能在于NK可以显著提高血小板环磷酸腺苷（cAMP）水平，抑制血小板活化[12]。

2.1.4 NK通过抗炎及抗氧化应激防止血栓形成的加速动物和细胞实验表明，NK可以通过抑制脂多糖（LPS）诱导的NADPH氧化酶2（NOX2）和Toll样受体4（TLR4）活化，显著抑制LPS诱导的活性氧（ROS）生成和核因子κB（NF-κB）活化，剂量依赖性地降低LPS诱导的炎症细胞因子水平，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）等，证实NK具有抗炎和抗氧化功效，而越来越多证据显示，炎症、氧化应激和凝血之间有强烈的相互作用，NK通过抑制炎症和氧化应激有效保护了小鼠免受LPS诱导的急性肾损伤和肾小球血栓的侵害，证实NK可以通过打破炎症、氧化应激和血栓形成之间的恶性循环，发挥抗血栓的作用[13]。

2.2 抗凝血作用

动物实验证实，NK可以通过阻断内、外源性凝血途径从而抑制凝血活酶的形成，延长凝血活酶时间，并且其在凝血第二阶段能够明显延长纤维蛋白凝固时间，在凝血的第三阶段明显延长凝血酶时间[14]，意味着NK对整个凝血过程都有一定抑制作用。相关人群研究也证实，NK在抗凝血方面的特殊功效。在一项人群实验中，每天给予3组受试者（健康志愿者、有心血管危险因素患者、透析治疗患者）2粒NK胶囊（2 000 FU/粒），2个月后发现所有组中凝血因子Ⅶ、Ⅷ及纤维蛋白原均显著下降，并且受试者未出现任何不良反应[15]。在另一项包含12例健康男性受试者的双盲随机对照研究中也得出相似的结论，受试者接受单剂量的NSK-SD 2 000 FU或安慰剂，发现2、4 h时NK受试者血液中抗凝血酶浓度显著升高，活化部分凝血活酶时间（APTT）明显延长，凝血因子Ⅷ活性在4、6 h时下降，6、8 h时该组的D-二聚体浓度也显著高于对照组，但这些变化均处于正常范围内，表明NK的抗凝血活性可能涉及多种不同的途径，而且不会增加出血风险[16]。高胆固醇血症患者的NK应用研究中也观察到NK与抗凝血作用之间的显著关联，每天给予高胆固醇血症患者NK胶囊2 000 FU 8周后，相比于安慰剂对照组，NK组血清中凝血酶原时间（PT）和APTT明显升高，进一步表明NK在各种人群中均有显著的抗凝血功效[17]。

2.3 改善血脂及抗动脉粥样硬化作用

血管的粥样变化与长期血脂异常密切相关，研究发现，NK具有一定的预防和降低血脂作用。动物实验结果显示，与高脂对照组相比，每天给予NK 280 FU/kg的动脉粥样硬化模型大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、动脉粥样硬化指数等均显著下降，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平明显升高，提示NK具有一定的改善血脂作用[18]。一项NK对颈动脉粥样硬化和高血脂患者的疗效研究中，NK组受试者每天口服NK 6 000 FU，持续服用26周后，其斑块面积和颈总动脉中膜厚度明显下降，同时观察到NK能显著降低受试者的TG、TC、LDL-C水平，并有提升HDL-C的作用，但其改善血脂作用与动脉粥样硬化的改善指标没有正相关关系，表明NK改善动脉粥样硬化作用可能不是直接通过降低血脂水平实现的，可能与其抗炎、抗氧化和溶栓作用有关[19]。

2.4 抗高血压作用

NK对高血压前期患者有一定的降压作用。在一项北美高血压人群（收缩压≥130 mmHg或舒张压≥90 mmHg）中进行的随机双盲安慰剂对照临床研究中，每天服用NK 100 mg的受试者在8周后，观察到收缩压和舒张压相较于安慰剂组均有降低，而这种降血压作用对于男性受试者更为显著[20]。另一项针对亚洲高血压1期人群的临床试验中，NK组（口服NK 2 000 FU/d）收缩压和舒张压在干预8周后比对照组平均降低5.55 mmHg和2.84 mmHg[21]。一项针对自发性高血压大鼠的动物实验对NK的降压作用进行了研究，通过比较NK和不具有蛋白酶活性的NK衍生片段，发现NK及其片段通过不同的机制发挥了降压作用，进食高剂量NK大鼠（2.6 mg/g饮食）收缩压、舒张压和血浆纤维蛋白原水平均显著降低，而NK片段则抑制了肾素、血管紧张素转化酶的活性以及血管紧张素Ⅱ浓度升高，表明NK可能是通过裂解血浆中纤维蛋白原发挥降血压的作用，其片段则可能是通过抑制血管紧张素Ⅱ来抑制大鼠的血压升高[22]。其他相关动物实验也均得到相似的结论[23-24]，从而表明NK可被开发为预防高血压和血管性疾病的新型膳食补充剂或功能性食品。

3 纳豆激酶在防治血管性疾病的应用前景

3.1 纳豆激酶安全性

纳豆的食用在日本有上千年的历史，安全性经得住检验，NK的安全性也在很多研究中得到验证[25-26]。口服NK后，血中优球蛋白溶解时间（ELT）大大降低，优球蛋白纤溶活性增强，血栓溶解面积和分解产物增加。国内学者在小鼠NK的毒性检测试验中通过大剂量喂食，结果也并未发现任何致畸现象[27]。动物实验显示，NK静脉注射会对小鼠血管及周圍组织有强烈刺激作用，大剂量注射则会导致小鼠死亡，原因可能与呼吸中枢抑制及出血有关，而经口大剂量服用NK的小鼠并未发现死亡及不良反应。因此，NK的给药途径上，口服给药安全性更高。但另一方面，在血液中NK的最高安全浓度上，仍然需要大量实验数据来确保临床应用的安全。

3.2 纳豆激酶的应用剂量

目前开发的NK制剂主要以口服为主，包括片剂、软胶囊、硬胶囊、缓控释制剂等，国际规定其含量单位为FU/片，国内专家建议NK最大摄入量为2 000～2 800 FU/d，35岁以上人群适宜服用[28]，日本营养健康食品协会规定的每日正常维持量则在2 000 FU以上。另外，如下人群不建议服用NK：（1）严重腹泻、呕吐、消化不良患者;（2）皮肤、内脏器官出血、渗血者;（3）需要促凝药物治疗的患者;（4）治疗中已经使用大量溶栓药物者;（5）具有出血性疾病遗传家族史患者;（6）妊娠及哺乳期妇女;（7）支架术后患者遵医嘱执行。

4 展望

血栓性疾病在全球范围内高发，预防和治疗血栓性疾病药物还具有很大的市场需求，NK在纤溶活性、安全性、成本和持续时间上都有独特优势，有望成为治疗和预防血栓性疾病的理想药物。另外，针对当前肆虐全球的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情，柳叶刀等杂志研究结果发现，重型或危重型新冠肺炎患者存在凝血功能异常，病毒感染机体后，攻击血管内皮细胞，致其损伤并诱发血管内弥漫性凝血，加之患者本身的基础疾病、激素使用等情况，极易形成血栓，进而导致全身器官衰竭危及生命。即使重症COVID-19患者经治疗恢复后，血管内弥漫存在的血栓同样会增加其静脉血栓栓塞症（VTE）的发生风险，留下长期的后遗症[29-30]。目前针对重型和危重型COVID-19患者VTE的预防，首推低分子肝素皮下注射的方式，但出血风险也相应增加。因此，鉴于NK突出的溶栓效果和抗出血倾向的特性，将其作为重型和危重型COVID-19患者VTE的辅助防治方案，具有一定的临床研究价值。同时，对于康复期患者，能否通过口服NK促进其康复，改善其后遗症状况，有待进一步研究和探讨。

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