鱼明胶凝胶包埋桉叶精油的控释及抑菌效果研究

续庭玮 周丽萍 闫吉成

摘要：桉叶精油具有广泛的生物活性，但其易挥发、运输与贮存不方便且高浓度的纯精油具有腐蚀性，使其应用受到了限制。为扩大桉叶精油的应用范围，研究用鱼明胶凝胶包埋桉叶精油，并对包埋后的凝胶性质进行评价。以鱼明胶凝胶的含水率、复水率、包埋率和抑菌效果为指标，探究桉叶精油浓度因素的影响;以释放率为指标，探究pH因素的影响。结果表明：（1）鱼明胶凝胶包埋100 μL桉叶精油时包埋率最高，为96%，随着包埋的桉叶精油的浓度的增加，包埋率降低;（2）鱼明胶凝胶的含水率与复水率均随着包埋桉叶精油浓度的不同而出现显著变化;（3）鱼明胶凝胶包埋桉叶精油后的释放率随pH的变化而变化明显，在pH为12时，释放率最高;（4）桉叶精油被鱼明胶凝胶包埋后仍有抑菌效果，并随包埋桉叶精油的浓度升高而升高。本试验为桉叶精油的稳定性的提高、控制释放、不良气味的掩盖及其在食品抑菌方面的应用奠定了基础。

关键词：桉叶精油;明胶;凝胶;包埋;稳定性

桉树属桃金娘科，速生树种，适应性强，在我国广泛种植[1]。桉叶精油是桉树叶油腺细胞分泌出来的芳香精油，含有大量具有强烈生物活性的有效成分，如酚类、黄酮类、皂甙、甾体、氨基酸、萜类等[2]。桉叶精油对食品中常见的致腐菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、黑曲霉等均具有一定的抑制性，可将其作为天然安全的抑菌剂添加到食品包装材料中以延长食品的保鲜期和货架期[3]。但桉叶精油热稳定性差，常温下易氧化，香气成分易挥发，功效作用持续时间短，不耐储藏保存，因此限制了其在食品、药品等领域的应用[25]。

包埋技术可提高植物精油的稳定性、降低植物精油的化学降解、稳定其生物活性，在一定程度上可解决植物精油应用所面临的问题[4]。凝胶包埋作为包埋处理方式之一，可强效提高植物精油的稳定性。凝胶是一种高分子聚合物，在特定条件下，体系中的高分子链相互交联形成三维网络结构，在溶剂内溶胀而不溶解。再加上它具有粘弹性和很好的生物相容性，因此在醫药、食品等行业得到了广泛的应用[67]。采用凝胶对桉叶精油进行包埋，可以将液态的精油转变成固体形式，便于添加到包装材料中，提高精油的稳定性，且利用凝胶的控释性，可使桉叶精油发挥长效缓释抑菌功能。鱼明胶是以鱼类加工废弃物——鱼皮、鱼鳞、鱼骨等为原料，由鱼胶原蛋白水解得到的一种高分子多肽聚合物[8]。安全无毒并且具有许多优良的物理和化学性质的鱼明胶已作为海洋资源开发利用的典范，成为食品加工领域中的重要新材料[9]。但采用鱼明胶凝胶包埋植物精油的研究甚少，因此，本研究利用鱼明胶制备凝胶，并用其包埋桉叶精油，研究桉叶精油不同的浓度对凝胶性能和精油包埋率及抑菌性能的影响，以期提高桉叶精油的稳定性，扩大其应用范围。

1材料与方法

11材料、试剂与仪器

111材料与试剂鱼明胶，250 BL60，越南Vinhwellness公司;桉叶精油，分析纯，金源天然香料有限公司;琼脂，食品级，河北亚信生物科技有限公司;氯化钠，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司;氢氧化钠，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司;酵母提取物，分析纯，安琪酵母股份有限公司。

112仪器与设备YP601N型电子天平1[准确度等级（Ⅲ）]，上海精密科学仪器有限公司;CP224C型电子天平2[准确度等级（Ⅰ）]，奥豪斯仪器（上海）有限公司;RHKT/C型磁力搅拌器1，IKA Works Guangzhou;EMS12型磁力搅拌器2，天津欧诺仪器仪表有限公司;B260型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂;DHG9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;Eppendorf 5810R 型台式低温离心机，德国Eppendorf公司;T6新世纪型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;LDZM60KCSⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;KQ300B超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司。

12方法

121包埋桉叶精油的鱼明胶凝胶的制备称取1 g鱼明胶，加入15 mL蒸馏水及5 mL NaOH溶液（01 mol/L），在35℃条件下磁力搅拌12 h[4]使其充分溶解，随后置于60℃恒温水浴锅中加热30 min。向加热变性后的鱼明胶溶液中分别加入不同浓度的桉叶精油（5、10、15、20、25μL/mL），将混合溶液放入35℃超声清洗机中超声30 min，使其形成均一溶液。最后将其放在室温条件下静置8 h，形成凝胶。

122凝胶含水率的测定称取10 g左右样品记为m1，置于恒重铝盒中，二者总重记为m2。将盛有凝胶样品的铝盒放入105℃烘箱中加热干燥至恒重，称得干燥后总重量为m3。计算样品含水率如式（1）：

含水率=m2-m3m1×100%（1）

123凝胶复水率的测定准确称取重量为m1烘干的鱼明胶凝胶成品，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水没过凝胶，静置复水24h后，取出凝胶沥干水分，用吸水纸吸干凝胶表面的自由水，测其重量为m[10]2。

复水率=m2m1（2）

124桉叶精油包埋率的测定[11]桉叶精油标准曲线的测定：用无水乙醇分别将桉叶精油稀释为不同浓度的标准液（1、05、06、068、08 μL/mL）。以无水乙醇为测定背景液，测定桉叶精油标准液在263 nm处的吸光值，以OD263 nm表示。以桉叶精油的浓度为横坐标、OD263 nm为纵坐标，绘制桉叶精油浓度的标准曲线[12]。（1）凝胶表面桉叶精油含量测定：将2 mL混有桉叶精油的凝胶制备液倒入直径2 cm的圆柱形模具中，成胶步骤同121。将凝胶样品从模具中取出后，用50 mL无水乙醇快速冲洗样品表面，随后用无水乙醇将冲洗液定容至100 mL，超声5 min后，测定该溶液在263 nm处的吸光度，计算样品表面的桉叶精油浓度c1。（2）凝胶内部桉叶精油含量测定：将上述冲洗掉表面桉叶精油的凝胶放入50°C水浴锅中进行加热处理，随后用50 mL无水乙醇提取桉叶精油，并用无水乙醇将提取液定容至100 mL，超声5 min至溶液均一透明。测定该溶液在263 nm处的吸光度，计算样品内部的桉叶精油浓度c2。

包埋率=c2c1+c2（3）

125桉叶精油释放率的测定在4个25mL的试管中制备1 g包埋15 μL/mL桉叶精油的鱼明胶凝胶待用，制备方法同121。分别配制pH为12[13]、69[14]、76、85[1]的01mol/L的磷酸缓冲溶液，模拟胃腔、口腔、小肠及大肠的pH环境，将缓冲液各取5 mL分别加到试管中的凝胶上，置于37℃水浴内。在不同时间段分别取100 μL的缓冲液（10、40、70、100、130、160 min），用乙醇稀释25倍后分别测定其在263 nm下的特征吸光值，以表示缓冲液中的凝胶分解释放桉叶精油的情况[15]。

126包埋桉叶精油的鱼明胶凝胶抑菌效果的测定将制备的鱼明胶凝胶置于锥形瓶中，在锥形瓶中加入适量去离子水，搅拌均匀，加盖密封，在超声波清洗机中于40℃超声振荡20 min。再将其转移至装有数粒玻璃珠的500 mL圆底烧瓶中，加水至圆底烧瓶中约含300 mL去离子水，连接挥发油测定器与回流冷凝管，收集挥发油测定器中的桉叶精油作为包埋后的桉叶精油备用。在LB固体培养基上接种浓度为10-8CFU/mL的大肠杆菌 并涂布均匀，在37℃恒温培养箱中培养12 h。12 h后取出培养皿，用直径为5 mm的无菌枪头在培养基上均匀打孔，用无菌镊子剔去孔内培养基，用无菌移液枪吸取1滴液体培养基封底。然后在孔内分别注入100 μL包埋后的桉叶精油，盖上培养皿盖后放置在37℃恒温培养箱中培养12 h，测量抑菌圈直径[16]。

13数据处理分析

文中试验数据均为3次平行试验的平均值，结果以平均值±标准偏差表示。实验数据用 Excel进行统计，采用 Excel 2016 及 Origin 85 软件进行数据整理和回归分析，并采用Origin 85软件进行绘图。

2結果与分析

21桉叶精油浓度对鱼明胶凝胶含水率的影响

如图1所示，样品均具有较高的含水率（>96%），桉叶精油添加浓度在0～25 μL/mL的范围时，对凝胶含水率无显著影响，这可能是因为鱼明胶吸水性能很好，易与水分子形成氢键，所以凝胶含水率普遍较高。

22桉叶精油浓度对鱼明胶凝胶复水率的影响

如图2所示，样品均具有较高的复水率（>13）。桉叶精油添加浓度在0～25 μL/mL的范围时，随着包埋桉叶精油浓度的提高，凝胶的复水率整体呈上升趋势，这可能是因为鱼明胶吸水性能很好，所以凝胶复水性能普遍较高。且桉叶精油在烘干的过程中被挥发，凝胶内部形成空腔[17]，包埋时桉叶精油的浓度越高，烘干后形成的空腔越多，凝胶可吸收的水分越多，复水率也就越高。

23桉叶精油浓度对鱼明胶凝胶包埋率的影响

如图3所示，样品均具有较高的包埋率（>92%），且桉叶精

图3桉叶精油浓度对鱼明胶凝胶包埋率的影响油添加浓度在0～25 μL/mL的范围时，随着包埋桉叶精油浓度的增加，包埋率呈下降趋势，主要是因为桉叶精油浓度较高时，鱼明胶不能完全包埋桉叶精油，表面油含量很高，导致包埋率降低。

24pH对鱼明胶凝胶包埋桉叶精油释放率的影响

如图4所示，其中（a）、（b）、（c）、（d）分别为包埋15 μL/mL桉叶精油的鱼明胶在pH分别为12、69、76、85时的释放率随时间的变化，其中释放率都随时间的增加而增加，在pH为12时，释放率始终最高，这是由于鱼明胶本质为多肽，强酸有助于加速鱼明胶的水解。

25鱼明胶凝胶包埋桉叶精油浓度对抑菌效果的影响

如图5所示，样品具有良好的抑菌性能，且桉叶精油添加浓度在0～25 μL/mL的范围时，抑菌圈直径随包埋的桉叶精油的浓度的升高而增大，这是由于桉叶精油的抑菌性能与其成分及成分含量有一定的关系，桉叶精油中的主体成分萜烯类、醇类、酚类等物质均具有一定的抑菌作用，因此桉叶精油包埋的浓度越高，凝胶的抑菌性能越好[18]。

3结论

（1）鱼明胶凝胶包埋桉叶精油后会对鱼明胶凝胶的含水率和复水率有一定的影响，若实际生产中这两个因素对生产结果影响较大，需要考虑包埋的桉叶精油的浓度对含水率和复水率的影响。（2）鱼明胶凝胶包埋5 μL/mL桉叶精油时包埋率最高，随着包埋的桉叶精油的浓度的增加，包埋率降低，在实际生产中需考虑经济效益，避免浪费，可选择包埋较低浓度的桉叶精油。（3）鱼明胶凝胶包埋桉叶精油后的释放率随pH的变化而变化明显，在pH分别为12、69、76、85时，pH为12时释放率最高，说明若制作成可食用凝胶使用时，在胃中释放率最高，使用过程中可适当延长咀嚼时间，增大桉叶精油的利用率。因为随着时间的延长，在pH为76时也可以达到较高的释放率，所以也可在开发可食用凝胶时，适当对成分进行改造，使其在小肠停留较长时间。（4）桉叶精油被鱼明胶凝胶包埋后仍有抑菌效果，并随包埋桉叶精油的浓度升高而升高。以鱼明胶凝胶对桉叶精油进行包埋，可提高其稳定性，同时可实现桉叶精油的缓释抑菌效果，使其便于作为天然食品抑菌保鲜剂使用。

本研究探讨了桉叶精油的包埋浓度对鱼明胶凝胶的各项凝胶特性的影响，不同材料的凝胶包埋桉叶精油后凝胶性质的变化和对桉叶精油性质的影响及新的包埋方式还有待研究。凝胶包埋精油的研究方向也可应用于其他精油，因为一般来说，各类精油的挥发率较高，凝胶包埋精油可以提高精油的稳定性，便于运输或掩盖气味[1920]。◇

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