核酸适配体在沙门氏菌快速检测中的研究进展

王思琪 陈萍 王平

摘要：沙门氏菌是人畜共患病原菌，严重威胁人体健康。为有效控制沙门氏菌感染食品，预防因沙门氏菌感染而引起的食物中毒，对其进行快速检测很有必要。核酸适配体作为一种新型的仿生识别分子能特异性结合靶标物质，为食品安全快速检测技术的实现开辟了一条新的路径。此项技术具有靶分子范围广、稳定性好、制备及修饰方便等优点。通过介绍核酸适配体的概念、作用机理及特点，将核酸适配体在沙门氏菌的具体应用和发展方向作进一步的阐述。

关键词：核酸适配体;沙门氏菌;快速检测;作用机理

中图分类号：TS207.4      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.057

Abstract：Salmonella is a pathogen shared by human and animals，which is harmful to people's health. In order to effectively control the food infected by Salmonella and prevent the food poisoning caused by Salmonella infection，it is necessary to detect it quickly. As a new biomimetic recognition molecule，aptamer can specifically bind to the target substance，which opens up a new path for the realization of food safety rapid detection technology. This technology has the advantages of wide range of target molecules，good stability，convenient preparation and modification. In this paper，the concept，mechanism and characteristics of aptamers were introduced，and the specific application and development direction of aptamers in Salmonella were further elaborated.

Key words：aptamer;Salmonella;rapid detection;mechanism

0   引言

食品安全始终是关乎国民健康的大事。据《中国食品安全战略研究》显示，因微生物污染而带来的食源性疾病被视为食品安全问题之首，沙门氏菌则是威胁人们食品安全的一种极为重要的致病菌。

沙门氏菌（Salmonella）是一种威胁人体安全的人畜共患病原菌，食用被其污染的食品会引发肠胃炎、伤寒等疾病，若不及时治疗，死亡率高达10%[1]，给人体健康造成威胁。我国规定检测食品中沙门氏菌的标准方法较为繁琐，耗费人力，花费时间一般需要4～7 d[2]。在食品工业快速发展的大背景下，如何发展满足沙门氏菌高效率、低成本检测需求的检测技术。研究者发现，利用核酸适配体这种新型识别分子，可以对沙门氏菌进行特异性识别检测。并且核酸适配体本身具有合成方便、成本低廉、高效识别等优势，与当前食源性致病菌检测的发展方向十分契合。

1   沙门氏菌概述

沙门氏菌是较为常见的可引起食物中毒的致病菌之一。可通过粪便或者口腔进行传播，并且沙门氏菌传播介质多为禽肉、蛋、奶等食品[3]。沙门氏菌作用机理主要是通过Ⅲ型分泌系统使毒力岛Ⅰ和毒力岛Ⅱ编码的一系列毒力因子作用在宿主细胞表面并在宿主细胞中大量繁殖复制。据研究表明，沙门氏菌血清型超过2 500种[4]。目前，我国对沙门氏菌快速检测标准方法为GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》，此方法的局限性在于检测时间长、操作繁琐等。近年来大量研究结果表明，可将核酸适配体应用到沙门氏菌的快速检测中。

2   核酸适配体概述

2.1   核酸适配体概念

核酸适配体（Aptamer）又称之为适体，是运用体外筛选技术即指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选出来的一种有15～40个碱基长度的单链结构DNA或RNA序列[5]。可以和特定的靶分子高亲和力、高特异性结合的新型寡核苷酸[6]。

2.2   核酸适配体的特点及作用机理

核酸适配体与传统抗体相比有类似的抗体识别功能并且是在体外经过化学筛选获得的，因此也叫做“化学抗体”[7]。与此同时，核酸适配体作为新一代的识别分子也有不同于传统抗体的特点：①核酸适配体可以结合的靶标范围广泛，运用SELEX技术可针对各类靶分子进行核酸适配体的筛选。可以是有机染料、氨基酸、蛋白质、致病菌等[8]。②核酸适配体合成成本较低，可以快速制备[9-10]。只需经过一次筛选和测序后，就可以随时通过化学合成仪进行合成。③核酸适配体在常温条件下可以保存，经过高温处理后仍然可以依据靶分子結构进行相应折叠。④易于修饰，核酸适配体可在任何位置进行标记。标记物常常选为有机荧光标记物、氧化还原标记物及纳米粒子等[11]。⑤核酸适配体具有高亲和力、高特异性的优势。由于在SELEX筛选过程中，具备亲和性的核酸适配体不断富集于文库中，因此文库对靶分子的亲和性不断提高[12]。

研究发现，当溶液中有目标物存在时，核酸适配体能在特定的条件下通过氢键、静电相互作用，碱基堆积、范德华力及构象互补等方法折叠，依据靶标的空间结构进行折叠，进而形成某种特殊三维结构，如假结、发卡、G - 四分体、凸环[13]对靶标进行特异性识别。

3   核酸适配体在沙门氏菌快速检测中的应用

3.1   荧光适配体技术检测沙门氏菌

荧光检测沙门氏菌的原理是当核酸适配体与靶标物质结合后，用荧光基团或淬灭基团来修饰核酸适配体，加入靶标菌后改变适配体的构象，从而产生荧光信号差异[14]。Duan N等人[15]构建出一种由AccuBlue（一种适配体链）染料与部分适配体杂交的互补链（cDNA）组成的传感器，当沙门氏菌不存在时，适配体不与靶标结合，不引起DNA链断裂使得荧光染料AccuBlue荧光增强。当沙门氏菌存在时，靶标与核酸适配体特异性结合导致DNA链断裂，荧光信号强度变弱。使用该法检测沙门氏菌，检出限达25 CFU/mL。Wang R J等人[16]通过适配体标记荧光碳点的方法对存在于鸡蛋壳和自来水中的沙门氏菌进行检测，检出限为50 CFU/mL。蒋晓华等人[17]研究合成对核酸适配体有高亲和力的金属有机骨架材料Uio-66-NH2，构建出荧光生物传感器特异性识别沙门氏菌，此方法检出限为7 CFU/mL，线性范围为1×101～1×105 CFU/mL。

3.2   电化学适配体技术检测沙门氏菌

电化学适配体技术是将核酸适配体和电化学传感元件固定在电极上，加入靶标之后引起电极表面修饰物的结构发生变化，电化学信号发生改变，进而对靶物质进行定量及定性分析检测[18]。Hasan M R等人[19]通过一步电沉积法在工作电极上修饰多壁碳纳米管，然后與沙门氏菌适配体连接以形成沙门氏菌适体传感器，使用该法检测显示肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的检出限分别为55 CFU/mL和67 CFU/mL。裴倩倩[20]构建了电化学传感器用于特异性检测鼠伤寒沙门氏菌，该方法利用核酸适配体与鼠伤寒沙门氏菌进行特异性结合，引发ExoⅢ催化的多重信号放大反应，在最佳条件下，检测范围1×101～1×107 CFU/mL。

3.3   表面增强拉曼散射适配体技术检测沙门氏菌

表面增强拉曼散射技术（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）是基于纳米技术和拉曼光谱技术发展而来的技术。具有样品量少、采集速度快等特点，被广泛应用于食品安全等领域。Li H等人[21]将沙门氏菌与适配体结合，选用对氨基苯硫酚（PATP）作为拉曼活性信号分子，使棒状金纳米粒子（GNRs）和拉曼热点形成的等离子体耦合，在菌液浓度为56×107～56×107 CFU/mL，检测限达9 CFU/mL。该方法已用于鼠伤寒沙门氏菌在牛奶中的检测。Xumin X等人[22]构建出一种基于表面增强拉曼散射的鼠伤寒沙门氏菌传感器。金纳米粒子作为捕获探针，被Cy3标记的互补序列修饰的纳米金颗粒作为信号探针。当鼠伤寒沙门氏菌存在时，与核酸适配体结合，使其部分从互补序列中脱杂，降低拉曼强度。在最佳条件下，浓度范围为1×102～1×107 CFU/mL时菌落数呈对数线性增加，检测限达35 CFU/mL。该方法在  1 h内即可完成，并成功地应用于加标牛奶样品的分析，结果良好，特异性高。

3.4   比色适配体技术检测沙门氏菌

Wu W H等人[23]研究出一种基于无标记核酸适配体和金纳米粒子形成的适配体生物传感器，将目标菌与适配体进行结合，吸附在未修饰的金纳米粒子表面以捕获目标菌，并通过目标菌诱导使得金纳米粒子发生聚集，在高盐条件下由红色变为紫色，检出限为105 CFU/mL。Duan N等人[24]以金纳米粒子为比色探针，磁性纳米粒子为分离探针，建立了一种灵敏、简便的鼠伤寒沙门菌检测方法。首先，将适配体分别固定在金纳米粒子和磁性纳米粒子表面;然后，将鼠伤寒沙门氏菌加入溶液中，纳米粒子表面的适体能够特异性地与靶标结合形成三角结构复合物，引起悬浮液褪色和紫外可见光信号变弱，进而对沙门氏菌进行检测分析，检测范围为25～105 CFU/mL，检出限达10 CFU/mL。

3.5   表面等离子体共振适配体技术检测沙门氏菌

表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术灵敏度高、操作性强，该技术利用金属薄膜光学耦合产生的物理现象来检测物质。Xu Y等  人[25]设计出新型、Ω型光纤局部化表面等离子共振适配体传感器用于实时检测沙门氏菌，固定在等离子体表面的适配体能够特异性捕获鼠伤寒沙门氏菌，导致吸收峰的剧烈变化，检出范围为5×102～1×  108 CFU/mL，检出限达128 CFU/mL。Oh S Y等人[26]设计出表面等离子共振芯片，将约为20 nm金纳米颗粒组装到透明基底上与适配体连接。当沙门氏菌存在时，改变芯片的消光位移，从而达到检测沙门氏菌的目的，该方法检出限为104 CFU/mL。狄文婷[27]构建了表面等离子体共振生物传感器检测肠炎沙门氏菌的方法，结果表明其最低检出限为2 CFU/mL。对超市购买来的鸡柳、猪肉、虾、鱼食品样品进行检测，其所含有的沙门氏菌含量分别为0，2～10，0，15～20 CFU/mL，对其结果进行平板计数验证分别为0，4，0，18 CFU/mL，证明了此检测方法的可靠性。

3.6   纳米金适配体技术检测沙门氏菌

纳米金是一种直径在1～100 nm极为微小的颗粒，具有催化作用强、生物相容性强等特点。当前有研究者利用纳米金与适配体结合技术对鼠伤寒沙门氏菌进行检测。具体来说，适配体与纳米金在溶液中结合，当出现沙门氏菌时，适配体特异性结合靶物质，从而引起纳米金状态改变，进而对目标菌进行定量及定性分析。当菌液浓度范围为1×101～ 1×106 CFU/mL时，检测限达7 CFU/mL[28]，此方法可实现对食品中的沙门氏菌进行灵敏并且快速检测。

4   结语

综上所述，核酸适配体靶标范围广、稳定性好、合成方便、易于修饰、亲和力强，能够特异性识别多种目标物质。与荧光、电化学、表面增强拉曼散射、比色、表面等离子体共振、纳米金等技术相结合，可以实现高灵敏、低成本的检测要求，因此成为了沙门氏菌快速检测方法的研究热点。近年来，核酸适配体高效筛选技术的研究得到了重大突破，提高了筛选的效率及质量。相信通过研究人员的不断努力，在其他食源性致病菌或其他领域高效快速检测中，核酸适配体会得到更加深入的应用。

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