CdTe-Al荧光探针测定小龙虾中的恩诺沙星残留

符 东,龚燕川,刘 帅,况利腾,青周林,王 曦,何照春,肖亚婷

（四川文理学院1.化学化工学院;2.特色植物开发研究四川省高校重点实验室,四川 达州635000）

喹诺酮类药物是21 世纪以来发展迅速的一类广谱抗生素,具有抗菌谱广、抗菌活性强、高效、毒副作用小等特点,在医学特别是兽医学中被广泛应用.恩诺沙星又为乙基环丙沙星,是人工合成的第3 代氟喹诺酮类抗菌药,具有抗菌谱广、杀菌力强、毒副作用小、半衰期长、体内分布广、价格低廉、与其他抗生素之间无交叉耐药性等特点,被广泛应用于家禽、畜牧、鱼、虾、蟹水产等养殖业中,在预防疾病感染和促进生长方面效果较好.［1-4］近年来,由于在水产养殖业中被滥用,导致在水产品中富集,并通过生物链累积,使其残留浓度加大,进而对人体产生危害.［5,6］Ramirez A J 等人［7］研究发现,喹诺酮类抗生素会严重损伤人体的消化吸收系统;Cabello F C［8］研究表明,恩诺沙星在人体中达到一定的浓度,会产生致癌、致畸等作用;梁惜梅等人［9］研究珠江口水产养殖区抗生素残留发现,水产品中恩诺沙星蓄积作用可对人体肝肾造成损害,浓度越大受损越严重.

目前,对恩诺沙星检测的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）或色谱-质谱联用法（LCMS）、酶联免疫分析法、化学发光分析法和荧光光谱法等.［10-14］高效液相色谱法结果准确,但前期处理方法复杂、检测周期长、仪器成本高等;酶联免疫分析法特异性强、灵敏度高,但前期处理工作特别是对试剂盒的制备要求繁琐苛刻;化学发光分析法分析速度快、灵敏度高,但检测体系不稳定,易受发光时间等因素影响;荧光光谱法具有灵敏度高、方法简单、重现性好、设备简单等优点,目前已报道的分析恩诺沙星残留的荧光光谱法,面临灵敏度低、选择性低、检测体系不稳定等缺点.因此急需一种设备成本低、操作方便快捷、灵敏度高、检测体系稳定的分析新手段用于恩诺沙星的检测.

本论文以CdTe 量子点为反应底物,在一定技术上制备成CdTe-Al 荧光探针,与恩诺沙星结合形成CdTe-Al-恩诺沙星体系,且恩诺沙星具有共轭结构和刚性,适合于荧光检测分析.CdTe-Al 荧光强度较弱,但Al3+能显著增强恩诺沙星的荧光强度,且CdTe-Al-恩诺沙星体系是牢固的配合物结构,大大增强了恩诺沙星的荧光强度,体系更稳定,不受外界共存物质的影响.对小龙虾中恩诺沙星残留检测具有效果较好,灵敏度高、成本低等优点,建立了痕量检测小龙虾中恩诺沙星残留的新方法.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

759CRT 型紫外可见分光光度计（上海菁华科技有限公司）、F-4500 型荧光分光光度计（日本日立公司）、megafuge 8R 型台式高速冷冻离心机（美国thermo 公司）、FSH-2A 型高速匀浆机（常州友联仪器研究所）、PHS-3E 型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、DS－3510DTH 型超声波提取仪（上海生析超声仪器有限公司）等;

恩诺沙星标准品（BR,上海阿拉丁试剂有限公司）、乙腈（色谱纯）、六水三氯化铝、二氧化碲、水合氯化镉、冰乙酸、醋酸钠、乙二胺四乙酸二钠等试剂均为分析纯.

1.2 CdTe-Al 荧光探针的制备

参照元晓云等人［15-17］的方法制备CdTe-Al并进行改进.把1.0 mmol 的水合氯化镉与2.4 mmol 巯基乙酸加入磁力搅拌中搅拌,先用氢氧化钠把溶液pH 调到11.0,加入一定量的盐酸羟胺后再用氢氧化钠把溶液pH 调到11.0,然后加入0.01 mmol 的二氧化碲,在200 ℃油浴中反应25 min 后,冷却,加入乙醇沉降分离后溶于水中,向水溶液中加入0.02 mmol 的六水三氯化铝和适量醋酸,在100℃磁力搅拌器中反应30 min后即得CdTe-Al 配合物,经紫外-可见和荧光光谱鉴定,配合物未出现独立个体的光谱特征,说明制备的CdTe-Al 荧光探针符合文献要求.

1.3 样品制备和处理

随机在不同市场不同售卖点购置小龙虾,去头、去壳等组织,取处理好的食用部位绞碎制成匀浆样品组织.参考Tao［18,19］等人的处理方法,并进行适当改进.准确称取5.00g 混匀的小龙虾匀浆样品组织置于10ml 离心管中,加入4.0mL 乙腈和0.04mL 冰乙酸提取液,高速匀浆1min, 超 声 提 取10min, 于10000r/min 离 心10min,收集上清液,残渣重复提取1 次,合并两次上清液.常温下氮气吹干,再用pH 为3.5 的HAc-NaAc 缓 冲 溶 液2.0ml 溶 解 残 渣, 用0.22μm 微孔滤膜过滤后各取2.0ml 至10.00ml容量瓶中定容备用.

1.4 恩诺沙星的检测

取1.0ml 浓度 为1.0×10-4mol/L 的CdTe-Al加入到1.0ml 不同浓度量的恩诺沙星标准溶液中,用pH3.5 的HAc-NaAc 缓冲溶液定容至10.00 ml,室温反应25min 后,以激发波长325 nm,发射波长440 nm 测其荧光强度.

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱特性

图1 可看出,单独的CdTe-Al 和恩诺沙星的荧光强度很弱,而CdTe-Al 与恩诺沙星作用后,荧光强度均明显增加.在一定浓度范围内,随着恩诺沙星浓度的增加,其荧光强度逐渐增强,表明CdTe-Al 荧光探针能进行恩诺沙星的检测.mg/kg、1.80×10-3mg/kg、2.52×10-3mg/kg、3.59×10-3mg/kg、4.67×10-3mg/kg 的CdTe-Al-恩诺沙星体系中恩诺沙星的浓度.

图1 CdTe-Al 体系的荧光光谱

2.2 最佳CdTe-Al 浓度的确定

研究表明,在一定范围内,随着CdTe-Al浓度的增加,体系荧光强度也相应增强.当CdTe-Al 浓度过低时,体系加入少量恩诺沙星就能引起强烈的荧光效应,虽然检测灵敏度提高,但其线性范围变小;当CdTe-Al 浓度过高时,体系荧光强度相对较强,此时加入的恩诺沙星所引起的荧光强度相对变化不明显,检测灵敏度降低.综合考虑到检测灵敏度和线性范围的前提下,实验体系加入CdTe-Al 溶液的浓度均为1.2×10-4mol/L.

2.3 缓冲液pH 值的影响

体系分别加入不同的缓冲溶剂进行考察缓冲剂种类和pH 值对体系荧光强度和稳定性的影响,体系分别加入EDTA-Mcllvaine 缓冲液、HAc-NaAc 缓冲液、磷酸盐缓冲液、氨-氯化铵缓冲液和Tris-HCl 缓冲液［20］结果表明,体系在酸性环境下荧光强度最大,最优的为HAc-NaAc 缓冲溶液.

实验以HAc-NaAc 作为体系的缓冲液,进一步考察体系荧光强度最大时的pH 值和体系稳定性.结果如图2 所示,当pH 在3.0-3.8 时,体系荧光强度最强,pH 在2.9-3.8 范围内体系荧光强度变化较小,处于最稳定状态,因此本实验把pH3.5 作为最佳实验条件.

2.4 温度和时间的影响

在其它最优实验条件下考察实验温度对体系荧光强度和稳定性的影响,结果发现,当温度在15-80℃范围内变化时,较低温度对体系的荧光强度和稳定性影响较小,但在室温条件下,随着温度的升高,体系的荧光强度逐渐下降,温度越高下降越明显,初步发现在高温条件下,破坏了CdTe-Al 量子点的结构而发生解离.因此,本实验体系温度在室温下进行.

同时考察了反应时间对体系荧光强度的影响,在60min 内,以每5min 为间隔测定荧光强度,结果如图3 所示.发现体系在前15min 内荧光强度有所变化,但随着时间推移,特别是20min 后荧光强度最大且稳定,并持续到60min不变化.因此,本实验选择在20min 对体系进行荧光测定.

图3 反应时间对体系荧光强度的影响

图2 pH 值对体系荧光强度的影响

2.5 共存物的影响

在小龙虾样品中加入一定量的恩诺沙星,使其制备的样品中恩诺沙星含量为1.80mg/kg,在本实验样品制备液中加入以下常见离子,浓度均为5×10-4mol/L,相对误差不超±5%,结果如表1 所示,可知所加入的离子对测定结果影响相对较小,可忽略掉.

表1 共存物的影响

Ca2+Ba2+Mg2+Cu2+Fe3+3.56-2.51 1.33-4.12-4.66 Cd2+Pb2+Vc酒石酸草酸-1.31-0.95 0.81 3.06 1.97共存物 相对荧光强度误差（%） 共存物 相对荧光强度误差（%）

2.6 回归方程和检出限

在最佳因素条件下,建立体系的荧光强度对恩诺沙星浓度的标准曲线,结果如图4 所示.由图可知,在7.19×10-4mg/kg～3.59×10-3mg/kg 范围内呈良好的线性关系,线性方程为:IF = 30.774C - 155.4,相关系数R2为0.9996,检出限为1.44×10-4mg/kg,可看出该体系对恩诺沙星检测的灵敏度很高,适合检测小龙虾组织中恩诺沙星残留.

图4 标准曲线

2.7 回收率和精密度测定

按照1.4 实验方法分别测定样品中恩诺沙星含量,然后向各样品中分别加入一定量的恩诺沙星标准溶液,测定回收率.上述各样品每次均做6 次平行测定,结果见表2. 回收率为98.5～104.0%,可知在B 市场A 卖点及C 市场B卖点所售卖的小龙虾中残留微量的恩诺沙星,而其他取样的市场售卖点含极微量或不含恩诺沙星,初步考虑B 市场A 卖点及C 市场B 卖点所售卖的小龙虾生长水质方面有一定污染,污染源可能来自于养殖场排放的污水或排泄物;也有可能所喂食饲料含有恩诺沙星抗菌药,用于促进生长和预防疾病等目的.建议对B 市场A 卖点及C 市场B 卖点所售卖的小龙虾及生长区域进行严格监督和管理,并避免长期食用这一区域的鱼虾等水产品.

表2 回收率和恩诺沙星的检测结果

2.8 CdTe-Al 荧光探针机理探讨

恩诺沙星在318nm 处有最大吸收峰,其荧光发射峰位于435nm,通过体系的吸收光谱和发射光谱得知,CdTe-Al 对体系的吸收光谱和发射光谱几乎无影响.而CdTe-Al 与恩诺沙星作用后,恩诺沙星的最大吸收峰红移到335nm,荧光发射峰红移到442nm,且荧光强度大幅度增强,初步认定Al3+与恩诺沙星形成稳定的络合物,增强了恩诺沙星内源性荧光强度,进而增强体系的荧光强度.［21］进一步研究发现,在溶液体系中加入一定量的乙二胺四乙酸二钠螯合剂后,测定体系荧光强度,发现恩诺沙星的最大吸收峰蓝移到330nm,荧光发射峰蓝移到439nm,均未检测到单独的CdTe 和恩诺沙星特征吸收光谱和发射光谱,说明CdTe-Al-恩诺沙星体系是牢固的配合物结构,否则乙二胺四乙酸二钠会竞争性与Al3+结合而产生单独的CdTe 和恩诺沙星特征吸收光谱和发射光谱.

结 论

本实验以CdTe-Al 荧光探针为研究对象,建立了CdTe-Al 荧光探针高灵敏检测小龙虾中恩诺沙星残留的新方法,实现了对小龙虾中残留的恩诺沙星可视化检测.与现有的测定方法相比较,该体系更稳定,不受外界共存物质的影响,且该方法具有操作简单、检测灵敏度高、成本低等优点,适用于小龙虾中恩诺沙星残留的快速检测分析.