具有广谱抑菌特性的嗜酸乳杆菌细菌素活性研究

孙华迪，蔡丽丽，陈晓静*，冉军舰

1.河南科技学院 新科学院，河南 新乡 453003 2.云南商务信息工程学校，云南 昆明 650051 3.河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003

目前各类化学防腐剂的副作用逐渐被人们关注，寻找各种生物活性物质取代化学防腐剂是食品安全领域亟待解决的问题。乳酸菌是应用于多种发酵食品的安全微生物，嗜酸乳杆菌是乳酸菌的一种，属于肠道益生菌，可以调整肠道中的菌群平衡，其分泌的细菌素对致病微生物及腐败菌产生拮抗作用[1]。细菌素是一些细菌在新陈代谢过程中产出的一类具有活性的肽或蛋白质[2-3]。早在20世纪20年代Gratia就发现V株大肠杆菌产生一种对Φ株大肠杆菌起拮抗作用的物质，这类物质被称为大肠杆菌素[4]，但是50年后才开始在分子生物学水平上对其进行研究。因此，随着细菌素不断地被发现，按照不同的标准将其进行分类。按生产菌的种类不同可分为革兰氏阳性菌细菌素和革兰氏阴性菌细菌素两类[5-6]；按照细菌素抑菌谱的大小可分为广谱细菌素、中谱细菌素和窄谱细菌素[5]；按照细菌素分子量大小、热稳定性以及结构可分为复合型大分子、羊毛硫细菌素、热敏感大分子蛋白和小分子热稳定肽，可简化为是否含有羊毛硫氨酸的细菌素[7-8]。

研究发现，细菌素是一种自然产生的蛋白类抑菌剂，它无抗药性，灭菌快，无残存且成本低，生产快速，可对食物腐败菌起抑制或杀灭作用[9-11]。因此，它在食品、农业、医药中应用广泛。Nisin是最早应用于食品行业中的细菌素，可以延长货架期，并且在保质期以内最大程度地保持风味不变，另外，在国外消费较多的罐装蔬菜中，Nisin经常作为添加剂使用，不仅能起到改善口感的作用，也是防止罐装蔬菜腐败变质的有效手段[12-13]。乳酸菌细菌素不仅可以有效地抑制动物体内的致病微生物的生长繁殖，提高动物的免疫力，还可以抑制养殖饲料中的有害微生物的增殖，所以细菌素作为抗生素的替代品添加入养殖饲料中也很有前景[14-15]。另外，乳酸菌细菌素的特点使其在食品防腐方面应用最多[16]，而且细菌素在食品工业上的应用也在不断拓展，可能会作为功能性食品出现在人们的视野中。将细菌素与食物混合,一起被人们食用，从而进入人体去改善肠道菌群，产生对人体有益的作用[17]；还有将细菌素与食品包装袋或保鲜膜结合使用，即在食品包装袋或保鲜膜上涂一层细菌素，可以在保藏或运输过程中防止食品发生腐败变质或微生物污染；甚至还有科学家尝试异源表达，通过基因导入的方式使某些菌株具有产细菌素的能力，对有害微生物起拮抗作用，从而保证食品质量安全[18]。另外，细菌素在人类健康方面也有新的应用。许多科学家研究发现，乳酸菌细菌素作为一种天然的可以抑制致病菌且无抗药性的蛋白类物质，在口腔和皮肤护理、呼吸道感染方面有深远的潜在影响[19]。近年来，随着对细菌素研究的深入，其功能逐渐地被认识、了解。但细菌素在食品保藏保鲜、医药健康、畜牧养殖等方面的应用还有很大的潜力。

本研究采用的嗜酸乳杆菌是课题组自行分离保存的一株细菌(GenBank登录号MF804413)，该菌所产细菌素具有良好的抑菌活性。作者对其抑菌活性和生物稳定性进行了分析，以期为嗜酸乳杆菌ZRX02所产细菌素在食品防腐、药物治疗、饲料添加等方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

试验菌株：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)ZRX02(GenBank: MF804413)为作者所在单位实验室保藏菌株。

指示菌：大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门杆菌(Salmonella)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。

1.2 主要试剂

乙酸乙酯、乳酸、乙酸：分析纯；胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶：上海亿欣生物科技有限公司；BHI培养基:北京奥博星生物技术有限责任公司。

植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌适用于MRS液体培养基。配方：柠檬酸氢二铵2 g、蛋白胨10 g、磷酸氢二钾2 g、牛肉膏10 g、一水葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、酵母膏5 g、硫酸镁0.58 g、吐温80 1 mL、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000 mL，调pH值至6.2～6.6，121 ℃灭菌30 min。

沙门杆菌、大肠杆菌、炭疽杆菌适用于LB液体培养基。配方：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，调pH值至7.0，121 ℃灭菌30 min。在液体培养基的基础上加入15 g琼脂粉，即得LB固体培养基。

金黄色葡萄球菌、枯草杆菌适用于牛肉膏蛋白胨培养基。配方：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、蒸馏水1 000 mL、牛肉膏3 g，调pH值至7.4～7.6，121 ℃灭菌30 min。

1.3 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；LYNX4000冷冻离心机：泰国Thermo公司；YRE-52 A旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；WFJ7200可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；JA2003电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；95-2磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；Model PHS-3C pH仪：上海盛磁仪器有限公司；SHP-250生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司；SW-CJ-1D(经济型)单人单面垂直净化工作台：中国苏州智净净化设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 嗜酸乳杆菌发酵上清液的制备

从-80 ℃的冰箱中拿出保藏的嗜酸乳杆菌菌种，以1%的接种量将菌种接种至50 mL的MRS液体培养基，置于生化培养箱中，在恒温37 ℃条件下培养18 h，即为第1次活化；将第1次活化的嗜酸乳杆菌以1%接种量接种至50 mL的MRS液体培养基，置于生化培养箱中，在恒温37 ℃条件下培养18 h，即为第2次活化；然后以同样的步骤进行第3次活化。将第3次活化后的嗜酸乳杆菌菌种以1%接种量接种至准备好的MRS液体培养基，在同样的条件下进行大量培养。将菌种发酵液在4 ℃下，10 000 r/min离心15 min，去沉淀留上清备用[8]。

1.4.2 抑菌试验

指示菌的培养：将实验室保存的指示菌菌种以1%的接种量接种到对应的液体培养基中，37 ℃过夜培养，备用。

抑菌试验：吸取100 μL大肠杆菌均匀涂布至LB固体培养基上，再打直径为6 mm的孔，将1.4.1的发酵上清液吸取100 μL加入孔内。在37 ℃恒温生化培养箱中放置约8 h后拿出，测量出现的抑菌圈直径[20]。

1.4.3 抑菌物质的初步鉴定

排除发酵液中有机酸的作用：取嗜酸乳杆菌发酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液调节酸碱度，直至pH值为5.0。同时用乳酸、乙酸调节空白培养基(MRS培养基)至pH值为5.0作为空白对照，按1.4.2进行抑菌试验。

排除发酵液中过氧化氢的作用：取细菌发酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液调pH值至7.0，再加入过氧化氢酶使其终质量浓度达到5 g/L，37 ℃水浴中放置2 h后取出，再将pH值调回5.0。通过牛津杯法[21]测试其抑菌效果。

1.4.4 嗜酸乳杆菌细菌素的粗提取

在前期研究的基础上[22]，通过乙酸乙酯萃取的方法粗提取嗜酸乳杆菌细菌素。将发酵上清液以1∶1的体积比与乙酸乙酯混合进行萃取，萃取时间为1 h，萃取2次，弃掉下层溶液保留上层溶液，且将上层的有机相进行旋蒸。旋蒸产物用pH=7.0的PBS复溶，复溶比例为100∶1(即1 000 mL的细菌发酵液用10 mL的PBS复溶液复溶)。

1.4.5 嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌谱测定

将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌、鼠李糖乳杆菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌、枯草杆菌、植物乳杆菌、无乳链球菌、嗜酸乳杆菌分别吸取100 μL均匀涂布至对应的固体培养基上，在涂布好的固体培养基上打直径为6 mm的孔，将粗提的细菌素吸取100 μL接入打好的孔中。放入37 ℃恒温生化培养箱，培养约8 h取出，测量出现的抑菌圈直径。

1.4.6 嗜酸乳杆菌细菌素稳定性的测定

1.4.6.1 热稳定性测定

将粗提取的嗜酸乳杆菌细菌素分别置于8个离心管中，将离心管分别在-80 ℃、-20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃条件下处理30 min，室温条件下放置30 min作为对照。待所有离心管处理完拿出冷却后，将损失的细菌素用双蒸水补回[22]。按1.4.2进行抑菌试验。

1.4.6.2 酸碱稳定性测定

将通过乙酸乙酯萃取法粗提取的细菌素分别置于8个离心管中，将离心管中的细菌素分别调pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在室温下放置24 h，再调回原来的pH值(pH=2.0)，以pH 2.0的作为对照。按1.4.2进行抑菌试验[23]。

1.4.6.3 蛋白酶的敏感性测定

称取胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶分别加入粗提细菌素中，使终质量浓度达到1 g/L，混匀，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl将每个细菌素的pH值调节至对应放入酶的最适pH值。在37 ℃条件下处理1 h，室温下放置24 h，待反应结束后，将pH值调回原始值。以未经酶处理的细菌素作为对照，按1.4.2进行抑菌试验。

2 结果与分析

2.1 抑菌物质的初步鉴定

嗜酸乳杆菌发酵后可以产生多种物质，如有机酸、过氧化氢等物质[24]，因此，抑菌物质的初步鉴定也就是排除有机酸以及过氧化氢对抑菌效果的影响。经过过氧化氢酶处理的发酵上清液比未经酶处理的发酵上清液抑菌效果较差，说明嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌效果不是过氧化氢的作用。经过乳酸、乙酸分别调节pH值为5.0的MRS培养基几乎没有抑菌效果。说明可以排除有机酸对抑菌作用的影响。

2.2 嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌谱

由表1可知，嗜酸乳杆菌细菌素可以有效地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌、枯草杆菌以及无乳链球菌，抑菌圈均达到30 mm以上，属于广谱细菌素。这也说明可以用嗜酸乳杆菌细菌素来抑制食源性致病菌及腐败菌，且抑菌效果良好。

表 1 嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌谱

2.3 嗜酸乳杆菌细菌素的稳定性

2.3.1 嗜酸乳杆菌细菌素的热稳定性

嗜酸乳杆菌细菌素热稳定性测定结果如图1所示。随着温度升高抑菌活性逐渐降低，在经过121 ℃处理30 min后，该细菌素依然保留90%的抑菌效果，说明嗜酸乳杆菌细菌素热稳定性良好。在经过-80 ℃、-20 ℃处理后，抑菌效果比室温对照的抑菌效果好，因此，低温保藏或超低温冻藏细菌素可以保持活性。

图1 嗜酸乳杆菌细菌素的热稳定性

2.3.2 嗜酸乳杆菌细菌素的pH值稳定性

嗜酸乳杆菌细菌素pH值稳定性测定结果如图2所示。随pH值的升高，嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌活性逐渐降低。在pH 2.0时，抑菌活性最强，在pH 9.0时仍保留64%的抑菌活性。说明该细菌素对酸碱都有很好的稳定性。

图2 嗜酸乳杆菌细菌素的pH值稳定性

2.3.3 嗜酸乳杆菌细菌素的蛋白酶敏感性

嗜酸乳杆菌细菌素对蛋白酶的敏感性试验结果如图3所示。在经过胰蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及中性蛋白酶处理后，细菌素抑菌活性分别保留73%、62%、79%、75%、73%，而经过胃蛋白酶处理后变化不明显。嗜酸乳杆菌细菌素对中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶较为敏感，对蛋白酶K最敏感，说明该细菌素是蛋白类物质。

图3 嗜酸乳杆菌细菌素的蛋白酶敏感性

3 结论

本试验排除有机酸及过氧化氢的影响，发现嗜酸乳杆菌发酵液中的抑菌物质是蛋白类物质。通过乙酸乙酯萃取法粗提的细菌素为广谱细菌素，可以有效抑制一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、炭疽杆菌、无乳链球菌、枯草杆菌以及李斯特氏菌。嗜酸乳杆菌细菌素不仅具有良好的抑菌效果，而且具有良好的热稳定性、pH值稳定性，且对蛋白酶敏感。该细菌素经过121 ℃处理30 min后，仍保存90%的抑菌效果；在pH=2.0时抑菌圈直径达到32 mm，碱性条件下(pH=9.0)保留64%的抑菌活性。当嗜酸乳杆菌细菌素经过胰蛋白酶、蛋白酶K处理后，抑菌活性仍分别保留73%、62%，在经过其他蛋白酶处理后都有不同程度的下降。这一系列的试验结果说明：嗜酸乳杆菌细菌素具有良好的抑菌效果、热稳定性、酸碱稳定性，且对蛋白酶敏感。这些特点都有利于该细菌素在食品、医药等工业上的应用。