谷胱甘肽对小麦粉面筋聚集特性的影响

李金河，张 霞，王 琦，陈 迪，贾 峰，梁 赢，王金水

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

小麦是世界上种植广泛、食用人口众多的粮食作物之一，小麦的种植几乎遍布我国各地,其2019年产量达到了13 106万t，约占我国年粮食总产量的1/5，与人们的健康生活息息相关[1]。面粉的加工特性在很大程度上取决于小麦粉在加入水混合后形成面团时的相互作用及形成的面筋蛋白的组成[2-3]。所有的小麦都含有醇溶蛋白和麦谷蛋白，它们一起形成面筋蛋白。也有研究表明，总蛋白的含量、醇溶蛋白与麦谷蛋白的比例以及亚组分的组成在决定最终面筋蛋白的性质方面都有一定的作用[4]。

面筋聚集仪是一种运用高剪切力来迅速检测面筋蛋白在面粉和水的悬浮液体系中的聚集行为，从而判断所形成面筋质量的仪器。它不仅能够预测普通小麦面粉吸水率、面团混合稳定性、韧性和延伸性等一些常规流变学特性指标，还可用于鉴别面筋蛋白品质，快速提供面筋品质信息[5]。Rakita等[6]通过面筋聚集仪来预测面包的品质；Marti等[7]也通过面筋聚集仪来确定面筋聚集特性与小麦品质相关蛋白组分含量的相关性。

在面团混合过程中加入小分子还原剂GSH能够导致麦谷蛋白大聚体解聚，从而降低强筋面团的延展性，引起面包体积增加[8]。Lagrain等[9]的研究证明GSH的添加对麦谷蛋白混合后的提取率没有影响，面包体积无显著变化。前人的研究也表明,GSH会优先与低分子量的游离巯基(如LMW-GS)反应形成稳定的二硫键[10-11]。虽然针对GSH对蛋白质性质的影响的研究已有相关报道，但是其对面筋蛋白聚集特性的影响机制尚不明确。因此，作者利用面筋聚集仪快速分析了二硫键还原剂GSH对小麦粉面筋蛋白聚集特性的影响，并通过检测小麦蛋白质中二硫键及游离巯基含量来分析GSH影响面筋聚集特性的分子机制。本研究可为小麦粉面筋聚集特性的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

小麦样品是购买自当地市场的新收获无虫害郑麦136号，于4 ℃环境中保存。

1.1.2 试验试剂

EDTA(乙二胺四乙酸)、DTNB(5，5′-二硫代-2-硝基苯甲酸)、Urea(尿素)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、Glycine(甘氨酸)、无水氯化钙：分析纯；GSH(还原型谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)：食品级。

Tris-Gly缓冲液：每升溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g Gly、1.2 g EDTA，pH=8.0。

缓冲溶液A：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS和0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

缓冲溶液B：10 mmol/L DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

缓冲溶液C：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS、0.1 mol/L Na2SO3、0.5 mmol/L NTSB2-和0.2 mol/L Tris-HCl，pH=9.5。

NTSB2-的合成方法：100 mg的DTNB溶解到10 mL 1 mol/L的亚硫酸钠中，同时调节pH=7.5，38 ℃水浴并通氧气直至亮红色变成淡黄色溶液，证明NTSB2-已经形成。

缓冲溶液D：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS、0.1 mol/L Na2SO3、0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

1.2 主要仪器与设备

BSA223S电子分析天平:赛多利斯科学仪器有限公司；101 A-2电热鼓风干燥箱:上海实验仪器厂有限公司；LFP-800 A高速多功能粉碎机:无锡锡粮机械制造有限公司；面筋聚集仪:德国Brabender公司；METTLER TOLEDO pH计：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 制粉

按照 GB/T 20571—2006方法测定小麦籽粒的原始水分，并根据籽粒原始水分含量和期望水分含量确定润麦加水量，将小麦水分含量调节到规定的要求，润麦水分 15%，润麦时间 24 h，润好后的小麦立即用LFP-800 A粉碎机打粉，过80目筛后的面粉装入自封袋中密封，在冰箱(4 ℃)中保存。

1.3.2 小麦粉水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016中的方法。

1.3.3 小麦粉面筋聚集特性的测定

根据Melnyk等[4]和Rakita等[6]的研究，使用面筋聚集仪对小麦粉面筋聚集特性进行测定。首先分别将GSH以0.06、0.12、0.24、0.36、0.48 mg/g的比例，GSSG以0.12、0.36 mg/g的比例加入到所制小麦粉中。将8.5 g 面粉分散在9.5 g水中，以水分含量14%为基础将水和面粉的质量按比例调节，以保持液固比(1.26)恒定。通过夹套样品杯循环水将样品温度保持在34 ℃,将桨叶设置为1 900 r/min，并进行7 min的样品测试。对每个样品进行评价,指标如下：峰值最大时间(PMT)、峰值扭矩(MT)、聚集能(AgE)(最大扭矩前15 s和最大扭矩后15 s与曲线围成的面积)，最大扭矩120 s后扭矩减小量(LT120)。

1.3.4 面粉与水混合后悬浮液中蛋白质中游离巯基及二硫键含量的测定[12-14]

参照陈万义等[14]的方法并做适当的修改。取面粉与溶液混合并搅拌至面筋起始聚集时间点(LOT)时的悬浮物0.25 g，加入2 mL Tris-Gly缓冲液后振荡15 s，以10 000 r/min离心5 min，倒出上清，向沉淀中再次加入1 mL Tris-Gly缓冲液，振荡均匀后以10 000 r/min离心5 min，保留沉淀。

蛋白质中游离巯基含量的测定：往所得沉淀中加入2.7 mL 缓冲液A，在室温下，先剧烈振荡30 s，接着继续缓慢振荡1 h, 再往其中加入0.3 mL 缓冲液B，在室温下继续振荡1 h，平衡后，12 000 r/min离心5 min，在412 nm处测定上清液吸光度。游离巯基含量计算公式：

A=εbc，

式中:A为光吸收值；ε(摩尔消光系数)=13 600 mol-1·L·cm-1；b为比色皿的厚度，cm；c为待测溶液中游离巯基的浓度,mol/L。

蛋白质中总巯基含量的测定：往所得沉淀中加入3 mL 缓冲液C，在室温下，先剧烈振荡30 s，接着继续缓慢振荡1 h，然后12 000 r/min离心5 min，吸取0.1 mL上清液，再往其中加入0.9 mL缓冲溶液D，混合均匀后在 412 nm 处测吸光度。二硫键含量的计算公式：

SS=TS-SH，

式中:SS为二硫键的含量,μmol·L-1；TS为测定总巯基的含量,μmol·L-1；SH为游离巯基的含量,μmol·L-1。

1.3.5 数据处理

所有试验均进行3次重复，采用微软Excel 2010和SAS 9.0 对数据进行处理和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 还原剂对小麦粉面筋聚集特性影响

图1为小麦面粉的面筋聚集特性曲线，所示面筋聚集特性曲线相关的参数列于表1中。在试验过程中，样品与水的混合液受到强烈的机械作用，在旋转元件的高速推动下，形成面筋网络，并且记录到扭矩曲线急剧升高。进一步的混合破坏了面筋网络，转矩曲线下降。通常峰值时间和聚集时间是谷蛋白聚集动力学的指标，与蛋白质和面筋含量呈负相关，即随着蛋白质和面筋含量的增加，PMT下降，且反映小麦面筋网络强度指标的峰值扭矩和聚集能与蛋白质和湿面筋含量呈正相关[6,15]。从图1及表1可以看出，随着GSH添加量的增加，PMT逐渐减小，MT却并没有增大，说明面筋聚集曲线PMT的提前并不是由蛋白质或湿面筋含量的增加而导致的。有报道称品质差的面粉的特点是稠度迅速增加，随后迅速分解，面筋的聚集时间较短，而强筋面粉的面团稠度增加速度相对较慢，达到峰值稠度需要更多时间[16]，从图1可以看出，随着GSH添加量的增加，面筋的聚集时间逐渐缩短，说明随着GSH添加量的增加，面粉品质在逐渐变差。从表1也可以看出，随着还原剂GSH添加量的增加，小麦粉的面筋聚集能逐渐减小，LT120却逐渐增加，说明GSH的加入破坏了面筋蛋白网络结构，使其稳定性显著下降。

图1 不同含量的GSH处理后小麦粉面筋聚集特性曲线

表1 不同含量的GSH处理后小麦粉面筋聚集特性的变化

2.2 小麦粉在GSSG处理后面筋聚集特性的变化

经过前处理的面粉和蒸馏水混合后在高速搅拌条件下，面筋组分在高剪切力的作用下被分离出来，然后发生聚集形成均匀的面筋网络结构[17]。从图2和表2可以看出，GSSG与GSH存在时面筋聚集特性的变化趋势显著不同。在两种含量的GSSG存在时，面筋的峰值最大时间与对照组相比并没有显著变化，仅表现为面筋聚集能下降，最大扭矩120 s后扭矩的减小量增加，说明GSSG的加入仅对面筋的稳定性有显著性影响。表明GSSG主要在蛋白质的重组过程中，即在面筋蛋白聚合的过程中参与反应，在蛋白质的解聚分离过程中不参与反应，从而仅表现为面筋网络结构的稳定性下降。也说明了面粉中加入的GSH参与了初始搅拌过程中面粉中蛋白质的解聚分离过程，从而改变了面粉的面筋聚集特性，使面筋的聚集时间缩短，PMT提前。

图2 不同含量的GSSG处理后小麦粉面筋聚集特性曲线

表2 不同含量的GSSG处理后小麦粉面筋聚集特性的变化

2.3 GSH处理后总蛋白中游离巯基的含量变化

从图3可以看出，GSH处理后的面粉与蒸馏水混合后，在搅拌至面筋起始聚集时间点(LOT)时的悬浮液中蛋白质所含有的游离巯基含量随着GSH添加量的增加而逐渐增加，表明GSH的加入在蛋白质解聚分离的过程中破坏了蛋白质间的二硫键。因此，结合2.2中的分析，可以认为GSH的加入，促进了蛋白质间二硫键的断裂，加速了面粉中蛋白质的解聚分离过程，从而使PMT提前。形成的游离巯基更有利于后续的面筋聚集过程，因此缩短了面筋聚集时间，该分析也与2.2中的分析结果相一致；加入的GSH通过巯基-二硫键的交换反应与蛋白质结合，阻碍了蛋白质之间的进一步交联，导致形成的面筋网络结构稳定性变差。

注：不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图4同。

2.4 GSH处理后总蛋白中二硫键的含量变化

从图4可以看出，GSH处理后的面粉与蒸馏水混合后，在搅拌至面筋起始聚集时间点(LOT)时的悬浮液中蛋白质所含有的二硫键含量随着GSH添加量的增加而逐渐减小。这可能是因为GSH与蛋白质间(内)二硫键反应，使蛋白质游离出游离巯基的同时，形成了GSSG或蛋白结合谷胱甘肽(GSSP)。也因为蛋白质间二硫键的破坏，其中较小的蛋白分子或蛋白亚基分子解离出来[18]，同未参与反应的GSH一起被Tris-Gly缓冲液洗脱至上清液中，使所测定的蛋白质含量有所减小，且减小量是随着参与反应的GSH的含量的增加而增加的。在图4中表现为二硫键含量的减少量随着GSH添加量的增加而不断增加，且整体减少量较游离巯基含量的增加量变化更大。

图4 GSH处理后总蛋白中二硫键的含量变化

3 结论

通过面筋聚集仪分析了GSH对小麦粉面筋聚集特性的影响，随着GSH添加量的增加，面粉峰值最大时间和聚集能逐渐减小，最大扭矩120 s后扭矩减小量逐渐增加，说明随着GSH添加量的增加，小麦粉的面筋聚集特性发生了有规律的变化。且通过对面筋起始聚集时间点(LOT)时的悬浮液中蛋白质所含有的游离巯基和二硫键含量的测定，以及GSSG对小麦粉面筋聚集特性的影响的分析，结果显示：GSSG的加入对面粉的峰值最大时间、峰值扭矩没有显著影响，游离巯基的含量随GSH添加量的增加逐渐增加，而二硫键的含量则逐渐降低。据此认为GSH的加入是通过巯基-二硫键的交换反应破坏了面粉中蛋白质间(内)的二硫键，加速了搅拌过程中面粉中蛋白质的解聚分离过程，从而导致面筋聚集的峰值扭矩时间提前，同时也对解聚后蛋白质的重聚过程产生影响，缩短了面筋聚合时间，而且小分子GSH与蛋白质分子的结合，成为蛋白质聚合反应的终止剂，阻碍了蛋白质之间的进一步交联，导致形成的面筋网络结构稳定性变弱，使面筋的聚集特性变差。