诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究进展△

李 星 ，谭敦勇 ，郭惠明 ，赵明一 ，朱 平

［1.吉首大学医学院，湖南吉首416000；2.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510010；3.中南大学湘雅三医院，长沙410006］

提要：诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通过重编程体细胞而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC 多能细胞的一种细胞类型。iPSCs 向心肌细胞分化是一种使心肌细胞再生，治疗心肌梗死、心力衰竭等相关疾病的一种新兴技术。本文通过对近年来发表的iPSCs 向心肌细胞分化的相关文献的整理、总结和分析，介绍近年来iPSCs 及其向心肌细胞分化的相关研究进展、所面临的问题以及未来的发展方向。

心血管疾病是全球疾病死亡的主要原因，每年导致大约1 700 万人死亡。由于复杂的致病因素，心血管疾病目前仍难以预防。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的获得，为心肌细胞的再生修复予以了新的希望。干细胞治疗心血管疾病，通过再生心肌细胞，成为目前公认的最有前途的治疗手段［1-2］。2006 年日本科学家Takahashi 等［3］利用病毒载体将 4 个转录因子 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 转入分化的成纤维细胞中获得了iPSCs。iPSCs的出现，解决了一直阻碍干细胞研究的排斥反应、伦理学、法律方面等难题，为相关疾病的研究和治疗打开了新的一扇门，成为学术界研究的一大热点。在近10 多年的研究中发现，不止成纤维细胞，几乎所有的体细胞都可重编程产生iPSCs［4］。然而，随着生物技术、研究水平的提高，仍然有诸如重编程的效率、肿瘤的形成、iPSCs 定向分化、目标细胞的纯化与富集等相关问题亟待解决，运用何种方法改进这些问题，成为目前相关研究的热点。本文通过对近年来iPSCs 向心肌细胞分化的研究进展进行综述，为临床治疗提供策略。

1 诱导多能干细胞

2006 年，日本科学家 Takahashi 等［3］首次报道通过DNA 途径，将克隆入转录因子的病毒载体导入小鼠成纤维细胞后培养出iPSCs。但由于c-Myc 这一常见原癌基因的加入、病毒的参与，iPSCs 向肿瘤细胞分化不可避免。这种方法不仅存在瘤变可能，诱导效率低、细胞定向分化能力差也成为这项技术的诟病。但是我们不可否认，该技术将当代医学许多不可能变成了可能。随着科学家们研究的深入，Nakagawa 等［5］通过去掉 c-Myc 因子，只 Oct4，Sox2 和 Klf4 等 3 个因子来诱导 iPSCs，可喜的是，在后来iPSCs 分化的过程中并没有肿瘤细胞的形成。2009 年，Yu等［6］通过非整合型附着体载体方法获得的iPSC，在去掉附着体后，一举解决了病毒载体和原癌基因c-Myc 导致癌变的可能。到目前为止，只有转录因子Oct3/4被认为是必不可少的，而Sox2、Klf4、c-Myc 则被认为是可以替代的转录因子［7］。通过RNA 途径诱导多能干细胞，避免了因为基因插入而导致的成瘤风险。2011 年，Anokye-Danso 等［8］通过RNA 水平的重编程，在外加Hdac2 的基础上，外源合成miR302/367，再将其克隆到pLOVE 载体上，最后把载体转染到人和鼠的成纤维细胞，成功重编程出iPSCs。2017 年，Kim 等［9］通过机械牵张刺激成功使体细胞重编程为iPSCs，但是在他们的研究中发现机械牵张刺激并不能提高病毒转导率。2019 年，Gandhi 等［10］发现人纤维蛋白原在iPSCs 二维和三维分化上效率提高了37%；同年，Gagliano等［11］使用微流体技术成功地使数百个细胞同时重编程，该技术与传统标准多孔培养条件相比，原料成本降低约100 倍。

iPSCs 通过一系列的分化过程，产生具有收缩功能的心肌细胞。这个复杂的分化过程是通过转录因子调控网络和信号通路来调节的，前期的相关研究也证实Tbx5、Hey2、Irx4、MLC2v、MLC2a、MLC1a 等基因调控心肌细胞的分化；同时，nodal、骨形态发生蛋白、Wnts、成纤维生长因子等信号亦调控着iPSCs 向心肌细胞分化；大量的研究也发现维甲酸可控制心肌细胞的识别。iPSCs 向心肌细胞分

化和胚胎心脏分化的机制类似，通过对iPSCs 向心肌细胞分化机制的研究，更有利于控制iPSCs 向心肌细胞定向分化。iPSCs 的辉煌研究历程，无疑证明其在治疗心血管疾病方面有着巨大的潜力，将iPSCs 诱导分化为心肌细胞，这对心肌病的基础研究和临床治疗都起到至关重要的作用，极大地促进了心肌病的研究发展［12］。

2 诱导多能干细胞向心肌细胞分化的方法

2.1 小规模分化策略

2.1.1 拟胚体生成法 拟胚体（embryoid body，EB）生成法是利用iPSCs 生成心肌细胞的最常用方法。EB 生成法使未分化的iPSCs 聚合体在悬液中生长，形成一种被称为EBs的结构［13］。EBs 是可以分化为内胚层、外胚层和中胚层的细胞群［14］。传统的EBs 生成方法，包括静态悬浮培养、悬滴和强制聚集。在无血清条件下，通过几种细胞因子（如激活素A 和BMP4）的参与，EBs 可以有效地分化为心肌细胞。Zhang 等［15］用 OCT4，SOX2，NANOG，LIN28 等慢病毒转导hiPSCs 后生成EBs，使其分化出具有功能的心肌细胞。证明iPSCs 是一种可行的心脏修复的自体细胞来源，也是心血管研究的有力工具。这些由iPSCs/EBs 分化而来的心肌细胞与人类胚胎干细胞产生的心肌细胞相似，并且表达了相似的表型、结构和功能特征。文章指出，由iPSCs 分化的心肌细胞培养过程中显示出Oct3 和Nanog 使细胞分化能力下降，而NANOG 和LIN28 则促进了细胞的分化。同时，电生理学研究表明，iPSCs 有一种像ES 细胞一样的能力，可以根据动作电位的特征分化成Nodal、心房及心室的表型，并通过β-肾上腺素能信号传导途径的刺激使搏动频率增加和动作电位持续时间下降。

2.1.2 诱导多能干细胞与内脏内胚层样细胞共培养 内脏内胚层（visceral-endoderm，VE）是在胚胎发育的早期阶段形成的胚外细胞层，分泌胚胎发育的关键因子。Mummery 等［16］报道了小鼠的VE 细胞共同培养可以有效诱导其分化为心肌细胞。Passier 等［17］在研究中发现，在20%胎牛血清（FCS）存在的情况下，我们通过与VE细胞，END-2共培养，可以诱导iPSCs 向心肌细胞分化。在这项研究中，细胞的分化程度和血清浓度呈负相关，同时，在无胎牛血清的情况下，与只有20%的胎牛血清相比，分化后的细胞搏动次数增加了24 倍。当抗坏血酸被添加到无血清的共培养体中，观察到细胞的搏动次数增加了40%。虽然END-2 的心肌诱导机制尚不清楚，但实验研究证明了END-2 的诱导活性，在HepG2 与END-2 之间有表达共同的蛋白质图谱。发现在两个介质中都存在6 种蛋白质，包括可能在上皮-间质转变（EMT）上发挥作用的蛋白质。然而，在Graichen 等［18］的研究中发现，在无血清共培养体中，即使有END-2 的参与，在分化的细胞数量超过10%后，很难有进一步的分化。通过筛选候选分子，确定了SB203580 这种特殊的p38 MAP 激酶抑制剂，是一种强有力的促进心脏生成的促进剂。但有趣的是，在SB203580 的浓度超过15 mmol/L 的情况下，心肌细胞的生成受到强烈抑制。因此，对p38MAP 激酶通路的调节，结合由END-2 细胞释放的因子，在早期决定心肌分化的效率中起着至关重要的作用。

2.1.3 通过特异性心源性生长因子使混合的iPSCs 单层细胞分化 该方法通过在不同动物模型中依次添加已知诱导心脏发育的生长因子，使iPSCs 直接向心脏谱系分化。通过这种特定生长因子的连续添加旨在体外模拟心脏组织的胚胎发育过程。外胚层中的Nodal 信号传导引起中胚层分化标志着原肠胚的发生。Nodal 在胚芽层发育中的作用至关重要。事实上，在早期胃肠形成过程中，Nodal 的丧失已被证明会导致中胚层的丧失和过度的外胚层分化，甚至胚胎的死亡。在脊椎动物胚胎发育中心是第一个可识别的组织。它原始的条纹形成于外胚层和内胚层之间的间胚层细胞层。这些细胞表达大量的中胚层基因，包括Wnt3、Brachyury T、BMP4和 MESP-1［19-20］。此外，MESP-1通过DKK1 和CER1 直接抑制Wnt 和Nodal 信号，对早期中胚层诱导具有较强的抑制作用。在此基础上，采用连续几轮的重组生长因子如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、BMP4、Wnt3 和激活素 A 等刺激 iPSCs，随后加入 DKK1 或其他Wnt 抑制剂，诱导细胞分化。此外，如Noggin，血管内皮生长因子，CHIR 和 IWR-1/IWP-2［21］，转化生长因子-β信号传导抑制剂，SHH 信号的激活［22］都已被证明能提升分化效率。

尽管小规模分化方案成功地使iPSCs 向心肌细胞分化，但是它们的可重复性是有限的，相关实验步骤的可控性以及试验方法的繁琐给iPSCs 的临床应用带来很大限制。此外，大型动物模型和组织工程也都需要持续提供庞大数量的心肌细胞，这就需要更先进的大规模iPSCs 向心肌细胞分化方案。

2.2 大规模分化策略

2.2.1 2D 单层培养法 iPSCs 的分化通常可以在传统的培养皿或烧瓶中进行，即在基质表面贴壁培养（2D）分化。2D 培养法具有超越传统标准方法的巨大优势。相对单层培养法也直接允许无浓度梯度的生长因子和小分子进入细胞，从而潜在地支持实验的再现［23］。单层培养法也没有要求EB 法的典型应答步骤，从而减少了操作过程中的步骤，以及组织培养用品的使用。因此，通过成倍增加培养皿或使用多层烧瓶，将2D 培养皿扩大用于iPSCs 大规模生产是可行的。然而，这仍然需要大量的空间和劳动力。由于对细胞治疗制剂生产成本的考虑，此方法最终会受到的经济限制［24］。

2.1.2 3D 悬浮培养法 三维空间的开发需要悬浮物的生成，在连续培养iPSCs 的培养基中，即在悬浮状态下培养单细胞［25］。然而，未改变基因组的iPSCs 持续单细胞培养法尚未有相关论文发表［26］。最近也有学者建议使用一种合成的、与《药品生产质量管理规范》（GMP）相兼容的水凝胶作为iPSCs 分化的3D 培养物［27］。水凝胶培养在一定程度上模拟了胚泡内细胞团中人胚胎干细胞的过渡阶段，为多能细胞的增殖分化提供条件［28］。但该方法与iPSCs 分化的相容性仍有待实践证明［29］。同时，在悬浮培养中植入单个iPSC 或细胞团，特别是在静态培养时，细胞易在重力作用下聚集。随后，经常观察到不受控制和有害的细胞团融合。最近，利用一种称为gellan 胶的高分子聚合物，证明了聚合体可以在静态条件下保持完全悬浮，并有效地防止融合［30］。然而，这种静态的培养环境不能使iPSCs 与代谢产物、营养物质、细胞因子等充分交换，培养环境的PH、氧等各种理化因素都不能形成一个动态平衡，因此，一批能使iPSCs 在动态环境中分化的反应器应运而生。

2.1.3 在生物反应器中使用仪器搅拌的3D悬浮培养法 据最近的文献表明，“自由漂浮”的悬浮培养法有望得到iPSCs生产和分化出107-1010 甚至更多数量的目标细胞［31］。因此，在生物反应器中使用仪器搅拌的3D 悬浮培养法在iPSCs 生产和分化中具有巨大的优势。通过叶轮控制搅拌，确保均匀混合和分布的细胞、培养基和气体，不同的叶轮类型、搅拌速度和细胞接种密度可用于控制细胞聚集和后续的进程［32］。Donghui 等［33］首次在动态的生物反应器用聚赖氨酸包裹藻酸盐的胶囊中实现了心肌细胞的诱导分化。完全仪器化生物反应器可以监视、调控关键工艺参数，包括pH 值和DO 等的在线评估。其他的在线监测代谢参数，如葡萄糖、乳酸盐和铵浓度也是大型生物反应器的监测指标［34］。目前正在开发更先进的工具，如无标签、非侵入性监测细胞的多能性与分化，以及自动化3D 显微镜，以更好地评估和控制干细胞的特性［35-36］。

综上所述，影响iPSCs 向心肌细胞分化的因素很多，其中一些包括起始细胞群、生长因子以及培养条件，详见表1。诸如很多物理刺激iPSCs 分化的方法（电刺激［37］、机械牵拉［38］），根据经验确定这些因素的最佳使用方案是iPSCs 向心肌细胞成功分化的关键。

表1 诱导多能干细胞的分化方法及特点

3 问题和展望

iPSCs 相关研究经历了10 余年，有一定进展。和胚胎干细胞相比较，iPSCs 避免了医学伦理学问题及免疫排斥等问题，但一些问题仍值得各国学者们深思和需要解决。首先，提高重编程效率是该领域研究亟待突破的一面壁垒，这与基因导入的方式、整合位点、表观遗传学、转录因子表达的数量和模式等多种因素有关，iPSC 的诱导方式在经过各国学者的改进，付出了巨大的努力，但其诱导方法的效率依然很低，在少量诱导完全成功的iPSC 中，由于其并不稳定的状态，现有的实验条件和技术并不能很好地控制其实验过程。其次是肿瘤发生的风险，通过逆转录病毒作为载体将多能性因子转入分化成熟的体细胞，这里的多能性因子包括c-Myc 这一常见原癌基因，再加上病毒的参与，细胞分化的不确定性，肿瘤发生的风险目前也无法避免。最后，iPSC 的定向分化、杂细胞的移除、目标细胞的富集与纯化以及移植后细胞的存活时间都需要学者们在今后的研究中去解决。

iPSCs 向心肌细胞分化是一项造福心肌梗死、心脏衰竭等心脏病患者的一门前沿技术，为心肌细胞的再生与修复打开了新的一扇大门，相关研究的机遇与挑战也并存。在诱导分化的机制方面还非常有限，提高诱导效率、控制iPSCs 定向分化以及简化其诱导途径、iPSCs 的大规模生产、诱导生成的心肌细胞的富集纯化等仍是今后研究的热点。