紫檀芪对宫颈癌细胞自噬及SIRT1-FoxO信号通路的影响*

钟桂兰，周 知，王 茹，符山花，刘晓芳

［1海南省妇幼保健院（海南省妇女儿童医学中心）妇科，海南海口572600；2黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040］

随着对细胞自噬的深入研究，人们越发认识到自噬在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，一方面自噬发挥保护细胞的作用，实现细胞器更新和代谢需求，另一方面自噬可作为Ⅱ型细胞程序性死亡，诱导细胞凋亡，因此研究自噬发生机制有利于临床宫颈癌的治疗［1-2］。有研究显示，sirtuin 1（SIRT1）不仅可通过叉头框蛋白O（forkhead box protein O，FoxO）调控自噬，也可调控氧化应激，参与细胞凋亡、增殖等过程［3-4］，SIRT1-FoxO 信号通路有可能成为临床上治疗宫颈癌的新靶点。紫檀芪（pterostilbene，PTE）类属于藜芦醇同系物，具有抗肿瘤和激活细胞自噬的作用［5］，但PTE激活自噬的具体作用机制未见相关报道。因此，本研究通过观察PTE 对人宫颈癌HeLa细胞自噬的影响，探究其相关作用机制。

材料和方法

1 主要试剂和仪器

PTE（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，货号：B21702-20 mg；DMEM、CCK-8 试剂盒、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RIPA 细胞裂解液和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液购自碧云天生物技术研究所；BCA 蛋白定量试剂盒和PVDF 膜购自上海炎熙生物科技有限公司；兔抗人p62、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和 β-actin 抗体均购自上海熹垣生物科技有限公司；兔抗人SIRT1 和FoxO抗体和羊抗兔IgG-HRP均购自上海恒斐生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自上海群己生物科技有限公司。

SpectraMax M3 型多功能酶标仪购自MD；Attune NxT型流式细胞仪和iBright FL1500型智能成像系统均购自Thermo Fisher Scientific；LVEM5 型台式透射电子显微镜购自Delong Instruments。

2 细胞培养及分组

人宫颈癌细胞株HeLa 购自中科院上海细胞库。培养液为含10% FBS 和1%青链霉素双抗的DMEM培养液，在37℃、5% CO2、相对湿度98%的恒温培养箱中培养。隔天换液，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验，根据CCK-8 实验测出PTE 对 HeLa 细胞的 IC50，以 IC50为 PTE 最大作用浓度进行分组，分别为0µmol/L、15µmol/L、30µmol/L 和60µmol/L PTE组，再开展后续实验。

3 方法

3.1 CCK-8 法测定PTE 对HeLa 细胞活力的影响收集对数生长期HeLa 细胞，用含有FBS 的DMEM 培养液调整细胞密度，按照每孔8×103个的数量接种至96孔板中。继续培养12 h，弃去旧DMEM 培养液，加入200µL 含有不同浓度PTE（PTE 终浓度分别为0、2、5、10、20、40 和 80 µmol/L）的 DMEM 培养液［6］，培养 24 h 和 48 h 后，弃去旧 DMEM 培养液，各孔加入180µL DMEM 培养液和20µL CCK-8 溶液。继续培养2 h后弃旧培养液，用多功能酶标仪测定450 nm波长处吸光度（A），同时设置空白对照组和0.1%DMSO 对照组，每个浓度设置6 个复孔。细胞活力抑制率（%）=［1-（实验组A值-空白对照A值）/（对照组A值-空白对照A值）］×100%。用SPSS软件计算PTE对HeLa细胞的半数抑制浓度（IC50）。

3.2 流式细胞仪测定PTE 对HeLa 细胞凋亡率的影响 收集对数生长期HeLa 细胞，用含有FBS 的DMEM 培养液调整细胞密度，按照每孔2.0×105个的密度接种到6孔板上，继续培养12 h，弃去旧培养液，加终浓度含有 0、15、30 和 60 µmol/L PTE 的 DMEM培养液，培养48 h 后，弃去旧DMEM 培养液，避光条件下加入FITC 和PI，标记细胞，具体操作按照An‑nexin V-FITC/PI 试剂盒说明书进行，每个浓度设置6个复孔，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

3.3 透射电镜观察PTE 处理后HeLa 细胞中自噬体 HeLa 细胞经0 µmol/L、15 µmol/L、30 µmol/L 和60 µmol/L PTE 处理48 h 后，用胰酶消化，离心后，用预冷的PBS 重悬细胞，离心、弃上清液，2.5%戊二醛固定15 min，脱水、包埋、切片，枸橼酸铅染色，用透射电镜观察HeLa细胞中自噬体。

3.4 qPCR 测定 PTE 处理 后 HeLa 细 胞中 SIRT1 和FoxO 的mRNA 表达 采用Trizol 法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，以其为模板进行qPCR，用GAPDH 为内参照。GAPDH 上游引物序列为5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，下游引物序列为5'-TGCACCACCAACTGTTAGC-3'；SIRT1 上游引物序列为5'-AGGCGGATTTCTGAGTTCGA-3'，下游引物序列为5'-CGTCCCTTGTAATGTTTCCC-3'；FoxO上游引物序列为5'-CTCATCACCAAGGCCATCGAG-3'，下 游 引 物 序 列 为 5'-CCATGGACG‑CAGCTCTTCTC-3'。按试剂盒说明建立终体积为20µL 的反应体系：2 µL 反转录产物，10 µL SYBR Green Mix，上、下游引物（10 µmol/L）各 0.5 µL，7µL ddH2O。热循环参数为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，40 个循环。结果采用2-ΔΔCt法进行计算。

3.5 Western blot 法测定 PTE 处理后 HeLa 细胞中SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax和Bcl-2水平用RIPA 细胞裂解液裂解经PTE 处理后的HeLa 细胞，4℃离心提取总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量，操作按照试剂盒说明书进行。SDSPAGE 分离目标蛋白（低压80 V，30 min；高压120 V，60 min），转至PVDF 膜上，5% BSA 封闭，分别加入相应兔抗人SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax、Bcl-2 和β-actin I 抗（1∶1 000），孵育过夜，加入羊抗兔IgG-HRP II 抗（1∶2 000），孵育2 h，ECL 显色，测定各蛋白条带灰度值，蛋白相对含量=目标蛋白灰度值/内参照β-actin蛋白灰度值。

4 统计学处理

使用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（mean±SD）形式表示。多组比较行单因素方差分析，任意两组相比行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PTE对HeLa细胞活力的影响

CCK-8 法结果显示，PTE 作用于 HeLa 细胞 48 h后，细胞活力受到抑制，活力抑制率随浓度增加而升高，具有浓度依赖性，见表1。PTE 对HeLa 细胞作用24 h 的 IC50为（53.87±5.48）µmol/L，48 h 的 IC50为（32.46±3.76）µmol/L，参照IC50值，后续实验采用0、15、30和60µmol/L PTE进行。

表1 不同浓度PTE对HeLa细胞活力的影响Table 1.The effect of different concentrations of PTE on the via‑bility of HeLa cells（Mean±SD. n=6）

2 PTE促进HeLa细胞凋亡

为验证PTE 促进HeLa 细胞凋亡，采用流式细胞术测定不同浓度PTE 对HeLa 细胞凋亡率的影响，与0 µmol/L PTE 相比，15、30和60 µmol/L PTE 处理后，HeLa 细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05），见图1。

Figure 1.The effect of different concentrations of PTE on the apoptosis rate of HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 µmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15µmol/L PTE；△P＜0.05 vs 30µmol/L PTE group.图1 不同浓度PTE对HeLa细胞凋亡率的影响

3 PTE增加HeLa细胞中自噬体数目

通过透射电镜观察到，无PTE（0 µmol/L PTE）处理的HeLa 细胞中自噬体数目较少，经15、30 和60µmol/L PTE 处理后，HeLa细胞中自噬体数目明显增加，见图2。

4 PTE 处理后 HeLa 细胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62水平比较

为进一步确定PTE 处理对HeLa 细胞自噬和凋亡的作用，不同浓度PTE处理后，通过Western blot法测定相关蛋白表达，结果显示，与0 µmol/L PTE 相比，15、30和60µmol/L PTE处理后，HeLa细胞中Bax和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高（P＜0.05），Bcl-2 和p62 水平显著降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05），见图3。

Figure 2.Comparison of the number of autophagosomes in HeLa cells after PTE treatment（lead citrate staining，scale bar=1 or 2 µm）.The autophagosome are indicated by black arrow.图2 PTE处理后HeLa细胞中自噬体数目比较

Figure 3.Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ and p62 in HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 µmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 µmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30µmol/L PTE group.图3 Western blot 法检测 HeLa 细胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白水平

5 PTE 处 理 后 HeLa 细 胞 中 SIRT1 和 FoxO 的mRNA及蛋白表达

为研究 PTE 处理对 HeLa 细胞 SIRT1/FoxO 通路的影响，不同浓度PTE处理后，通过Western blot法测定相关蛋白表达，结果显示，与0 µmol/L PTE 相比，经 15、30 和 60 µmol/L PTE 处理后，HeLa 细胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且呈浓度依赖性（P＜0.05），见图4。

讨 论

Figure 4．Expression of SIRT1 and FoxO in HeLa cells after PTE treatment.A：the mRNA expression of SIRT1 and FoxO detected by qPCR；B：the protein expres‑sion of SIRT1 and FoxO detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 µmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 µmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30.0µmol/L PTE group.图 4 PTE 处理 后 HeLa 细 胞中 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表达

宫颈癌发病率和病死率逐年升高，全球每年新增患者近50万人［7］，近年来，自噬在肿瘤进程的作用受到越来越多研究者们的关注，有望成为肿瘤治疗中促进肿瘤细胞凋亡的新靶点。PTE 是主要从葡萄和蓝莓中提取而来的天然化合物，是一种天然的抗氧化剂。最新研究显示，PTE生物活性广泛，具有显著的抗肿瘤活性；研究显示，PTE可激活人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞自噬，抑制其增殖，促进其凋亡［8］。刘盛楠等［9］研究显示 PTE 通过上调 Bax、Fas、细胞色素C和caspase-3，下调Bcl-2，抑制HepG2细胞增殖并促进其发生凋亡。本研究观察到，经不同浓度PTE 处理后，HeLa 细胞活力抑制率、细胞凋亡率依次升高，提示PTE 可以抑制HeLa 细胞活力，促进细胞凋亡。细胞凋亡是细胞程序性死亡进程，主要受抑凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 调控，本研究进一步研究结果显示，PTE 处理后，HeLa 细胞中Bcl-2 水平降低，Bax 水平升高，提示 PTE 通过上调 Bax、下调Bcl-2而抑制HeLa细胞增殖，促进其凋亡。

自噬与肿瘤细胞凋亡密切相关，研究显示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导因子诱导剂TIC10 联合阿司匹林，可通过促进自噬，促进宫颈癌细胞凋亡［10］。LC3 由LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两个亚型组成，细胞发生自噬时，LC3-Ⅰ经加工形成LC3-Ⅱ，而p62 蛋白首先与泛素化的蛋白质结合，随后与LC3-Ⅱ结合形成复合物，从而被降解，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白水平常用来检测细胞是否发生自噬［11-12］。研究显示，PTE可通过上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平，促进人口腔癌细胞自噬，以抑制其增殖，促进其凋亡［13］。本研究观察到，经PTE 处理后，HeLa 细胞中自噬体数目增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高，p62 水平降低，说明 PTE 可促进HeLa 细胞发生自噬，并通过此机制促进细胞凋亡，但是PTE 通过调控何种信号通路诱导HeLa 细胞自噬还有待进一步研究。

FoxO 主要由 FoxO1 和 FoxO3 组成，对肿瘤细胞增殖和凋亡具有重要的调控作用。研究显示，FoxO3 高表达可促进结肠癌细胞凋亡［14］。SIRT1 是FoxO3 的上游通路，可调控 FoxO3 水平，SIRT1 活化剂激活FOXO1 的脱乙酰作用后，可刺激人皮肤成纤维细胞发生自噬［15］。此外研究显示，PTE 可通过激活SIRT1/FoxO1信号通路，避免人脐静脉内皮细胞再灌注损伤［16］。本研究观察到，PTE处理后，HeLa细胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白水平升高，说明PTE 调控细胞 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表达，推测PTE通过调控SIRT1-FoxO通路，调控自噬、凋亡相关因子表达，从而促进细胞自噬和凋亡

综上所述，PTE 可通过激活SIRT1-FoxO 通路抑制HeLa 细胞增殖，促进细胞自噬、凋亡。然而PTE作用后诱导的自噬与凋亡之间是否有关联，以及PTE在体内治疗的作用有待进一步实验验证。