斯钙素2在糖尿病视网膜病变中的表达和意义*

常永杰，周利晓

（郑州大学第五附属医院眼科，河南郑州450052）

近年来，糖尿病的发病率持续升高，并呈现年轻化的态势。而糖尿病作为一种代谢性疾病，可引发诸多严重的并发症，例如糖尿病足、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）、中风、脂肪肝及肾脏疾病［1-2］。其中DR 严重影响糖尿病患者的生活品质，临床上的表现为黄斑水肿、视网膜新生血管和玻璃体出血等，患者如不及早干预治疗，严重的可导致失明［3-4］。临床上，针对DR 的治疗主要有激光治疗、抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth fac‑tor，VEGF）治疗和皮质类固醇治疗［5-6］。已有研究表明，视网膜血管内皮细胞的异常增生是DR 的一个重要特征，DR 的病理发展过程是多因素共同的结果，其发病机制还不是特别清楚，有待进一步深入的研究［7］。斯钙素2（stanniocalcin 2，STC2）是一种体内广泛表达的可分泌蛋白，近年来越来越多的研究发现其异常表达与多种疾病存在密切的联系，主要集中在恶性肿瘤中，如肺癌、肝癌、乳腺癌等［8-9］。目前的一些研究表明，STC2在糖尿病的发展过程中发挥潜在的功能，但关于其在DR 中的表达尚无相关的报道。本研究从糖尿病大鼠模型入手，检测STC2 在DR大鼠玻璃体中的表达，分析其与VEGF的联系，并在大鼠视网膜神经节细胞中探讨STC2和VEGF表达上的调控关系，对于深入分析STC2 在DR 中的作用具有一定的启发意义。

材料和方法

1 主要试剂

B27 无血清培养基和培养细胞用双抗购自Gib‑co；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR实时荧光定量PCR 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒和蛋白marker 购自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 细胞裂解液和预制SDS-PAGE 胶购买于碧云天生物科技有限公司；STC2 ELISA 试剂盒购自上海江莱生物科技公司；VEGFA ELISA 试剂盒购自Abcam；VEGFA和STC2重组蛋白均购自北京义翘神州公司；抗STC2抗体和Protein A/G 琼脂糖珠购自Santa Cruz；抗VEGF 抗体、羊抗鼠II 抗、羊抗兔II 抗和用于免疫共沉淀的IgG均购自Proteintech。

2 实验动物

Wistar大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号为SCXK（沪）2017-0005，随机分为正常对照（control）组和DR 组，每组12 只，糖尿病模型通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）进行构建，STZ使用0.1 mmol/L的柠檬酸钠溶液配制。腹腔注射2 d 后，尾静脉取血测定血糖浓度，血糖浓度高于20 mmol/L 认为糖尿病模型构建成功。糖尿病模型组每周腹腔注射STZ 2 次，维持4 周，然后继续观察至第8 周，每两周测定一次血糖。DR 模型构建成功的标志是大鼠眼睛晶体混浊，并伴有活动迟缓、毛发变黄等情况［10］。大鼠血糖水平采用葡萄糖氧化酶法，使用的设备是罗氏的血糖仪及对应试纸。

3 主要方法

3.1 大鼠视网膜神经节细胞培养 大鼠视网膜神经节细胞购于普诺赛生物技术公司，培养于大鼠视网膜神经节细胞完全培养基，添加B-27 和细胞培养级双抗，置于37℃、5%CO2培养箱中。细胞传代使用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法，传代不超过5次。

3.2 RT-qPCR 大鼠玻璃体组织经匀浆后，加入RNA 提取试剂，室温反应10 min，加入相同体积氯仿，剧烈振荡30 s 后静置5 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清转移到新的离心管中，加入相同体积预冷的异丙醇溶液，混匀后静置5 min，12 000 r/min 离心10 min，小心弃去上清，75%乙醇洗涤白色沉淀2次，得到的白色沉淀即为总RNA。风干后加入经DEPC 预处理的去离子水，使用翊圣的反转录试剂盒预处理RNA，去除可能残余的基因组DNA，加入逆转录酶反转录合成第1 链cDNA。使用翊圣的SYBR荧光定量PCR 试剂盒配制反应体系，熔解曲线确定引物特异性，2-ΔΔCt法分析 STC2 和 VEGF mRNA 的相对表达水平。STC2 的正向引物序列为5'-CTGGGC‑CAGTTTGTGACCC-3'，反向引物序列为5'-ACG TCATGCAAATCCCATGTAAA-3'；VEGF 的正向引物序列为5'-GCTACTGCCGTCCGATTGAG-3'，反向引物序列为5'-ACTCCAGGGCTTCATCGTTACAG-3'；内参照β-actin 的正向引物序列为5'-GTGACGTTGA‑CATCCGTAAAGA-3'，反向引物序列为5'-GCCG‑GACTCATCGTACTCC-3'。

3.3 Western blot 实验 在大鼠玻璃体组织中加入RIPA 裂解液，经超声破碎后，12 000 r/min 离心，去除沉淀，浓缩蛋白裂解液，经SDS-PAGE 分离，转印到PVDF 膜上；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 洗涤2 次后，4℃过夜孵育I 抗，TBST 洗涤3 次，室温孵育 II 抗 1 h，TBST 洗涤 3 次后，经 ECL 显影。采用Quantity One软件进行蛋白表达量的半定量分析。

3.4 ELISA实验 大鼠玻璃体组织经PBS反复润洗后，收集润洗液，冷冻浓缩，浓缩液加入预包被好的STC2和VEGFA试剂盒中，37℃反应1 h；加入生物素标记的抗体工作液，反应30 min；弃去液体，甩干，加入生物素标记的抗体，37℃反应1 h；弃去液体，甩干，洗板3 次，加入链亲和素-辣根过氧化物酶工作液，37℃反应30 min；弃去液体，洗板3 次，加入四甲基联苯胺溶液，37℃反应15 min；当标准品孔呈现明显梯度，加终止液，450 nm波长下测定吸光度。

3.5 VEGFA或STC2蛋白处理大鼠视网膜神经节细胞 将大鼠视网膜神经节细胞接种于6 孔板中，培养 24 h 后，用 100 µg/L 的 VEGFA 或 STC2 蛋白处理细胞。孵育24 h 后，回收培养上清液，用ELISA 测定其中STC2 和VEGFA 的水平；细胞刮取后，经预冷的PBS 洗涤 2 次，用 RT-qPCR 和 Western blot 检测细胞中STC2和VEGF的表达水平。

3.6 免疫共沉淀验证VEGF 与STC2 的相互作用将大鼠视网膜神经节细胞接种于15 cm 培养皿中，VEGFA 蛋白预处理 6 h；刮取细胞，PBS 洗 2 次，加入1 mL 低强度RIPA 裂解液冰上裂解1 h；离心取上清液，加入Protein A/G 琼脂糖珠，于4℃冰箱中旋转孵育1 h；然后等分到两个离心管中，分别加入IgG 和抗VEGF 抗体（1∶100 稀释），于4℃冰箱中继续孵育12 h；然后 500×g离心，收集琼脂糖珠，低强度 RIPA 裂解液轻轻洗涤2次，收集琼脂糖珠；加入RIPA裂解液和蛋白上样溶液，99℃加热10 min；离心取上清，去除琼脂糖珠，后续步骤同常规Western blot。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 软件处理数据。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用Student'st检验。两变量的相关性采用Pearson分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DR大鼠玻璃体中STC2的表达升高

分别在第2、4、6 和8 周检测对照组和模型组动物血糖，模型组动物血糖均超过20 mmol/L，见表1。这表明STZ 注射的糖尿病大鼠模型构建成功。糖尿病模型维持8 周后，大鼠眼球出现晶体状混浊现象，则认为DR 模型构建成功。RT-PCR 和Western blot结果显示，DR 组中STC2 的mRNA 和蛋白水平较正常对照组显著升高（P＜0.01），见图 1A～C。鉴于STC2 属于分泌型蛋白，进一步通过ELISA 测定大鼠玻璃体润洗液中STC2的蛋白含量，结果显示，DR组分泌的STC2 蛋白水平也显著高于正常对照组（P＜0.01），见图1D。

表1 不同时点糖尿病模型和对照组大鼠血糖水平的比较Table 1.The blood glucose concentration in diabetic model and control rats at different time points（mmol/L.Mean±SD. n=12）

Figure 1.The expression level of STC2 was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of STC2 was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of STC2；C：the relative protein level was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.图1 DR大鼠玻璃体中STC2的表达升高

2 VEGF在DR大鼠玻璃体中表达升高

相对于正常对照组，DR 组中 VEGF 的 mRNA 和蛋白水平明显升高（P＜0.01），见图2A～C。进一步通过ELISA 检测VEGF 信号通路关键的VEGFA 的分泌水平，结果显示，DR组大鼠玻璃体VEGFA 蛋白分泌水平显著高于正常对照组（P＜0.01），见图2D。

Figure 2.The expression level of VEGF was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of VEGF；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGFA was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.图2 DR大鼠玻璃体中VEGF的表达升高

3 STC2与VEGF的表达水平呈正相关关系

通过分析STC2 与VEGF 表达的相关性发现，在mRNA 水平上，STC2 与 VEGF 的表达水平呈正相关关系（r=0.96，P＜0.01），而在蛋白水平，分泌的STC2蛋白与VEGFA 蛋白也存在较强的正相关关系（r=0.78，P＜0.01），见图3。

Figure 3.The correlation analysis between STC2 and VEGF expression levels in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy.A：the correlation between VEGF and STC2 mRNA levels；B：the correlation between VEGFA and STC2 secretion levels.图3 DR大鼠玻璃体中STC2与VEGF表达水平的相关性分析

4 VEGFA 在大鼠视网膜神经节细胞中诱导STC2表达，并促进其分泌

为了进一步探讨STC2 和VEGF 的关系，我们用VEGFA 处理大鼠视网膜神经节细胞，24 h 后检测STC2 的表达水平，结果显示，VEGFA 处理能够促进大鼠视网膜神经节细胞中STC2 的mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.01），见图4A～C。同时通过ELISA 考察VEGFA 处理对于STC2 分泌水平的影响，结果显示，VEGFA 也能够诱导大鼠视网膜神经节细胞分泌大量STC2蛋白（P＜0.01），见图4D。

Figure 4.VEGFA induced STC2 expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of STC2 was examined by RT-qPCR；B：the protein level of STC2 was tested by Western blot；C：the relative protein level of STC2 was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.图4 VEGFA诱导大鼠视网膜神经节细胞中STC2的表达并促进其分泌

5 STC2 蛋白促进大鼠视网膜神经节细胞中VEGF的表达

为了观察STC2 对于VEGF 信号通路的关系，我们进一步分析STC2 对VEGF 的反馈调节。用STC2蛋白孵育大鼠视网膜神经节细胞，24 h 后检测VEGF的mRNA 和蛋白表达水平，结果显示，STC2蛋白能够诱导VEGF 的表达水平上调（P＜0.01），见图5A～C。ELISA实验结果显示，STC2蛋白也能够促进VEGFA的分泌，见图5D。

6 STC2与VEGF存在相互作用

免疫共沉淀实验结果显示，采用VEGF 抗体可以免疫沉淀出STC2蛋白，说明STC2与VEGF 之间存在紧密的相互作用，见图6。

讨 论

本研究从构建DR 大鼠模型入手，分析DR 大鼠玻璃体中STC2 的表达，发现STC2 在DR 大鼠玻璃体中的mRNA 和蛋白水平都显著上升。进一步发现在大鼠视网膜神经节细胞中，VEGFA 不仅能够上调STC2的mRNA和蛋白表达水平，也能够促进STC2的分泌。STC2是一种糖蛋白，最初的研究表明STC2在调控钙磷平衡方面发挥重要的功能［11］。STC2 在体内广泛表达，近年来其在恶性肿瘤中的研究越来越广泛，其异常表达与多种恶性肿瘤的预后存在紧密的联系［12］。同时，也有越来越多的证据显示，STC2在代谢性疾病中也发挥重要的功能。在高脂饮食和瘦素基因敲除2 种脂肪肝模型中，肝脏中的STC2 表达显著下降［13］；陶文玉等［14］的研究也发现在 STZ 诱导的糖尿病模型大鼠肝脏中STC2 的表达也显著上升，并且 STC2 可以激活 STAT3 和 NF-κB 信号通路，介导肝脏炎症应激的过程。这些研究表明STC2 可能参与糖脂代谢，介导炎症反应，而DR 作为一种危害极大的糖尿病并发症，STC2 在DR 中的表达及其调控功能尚无相关的报道。

Figure 5.STC2 induced VEGF expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of VEGF was examined by RT-qPCR；B：the protein level of VEGF was tested by Western blot；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGF was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.图5 STC2诱导大鼠视网膜神经节细胞中VEGF的表达并促进其分泌

Figure 6.The interaction between VEGF and STC2 in rat retinal ganglion cells.A：the total protein was pretreated with Protein A/G agarose beads for 1 h，divided into 2 tubes and incubated with IgG and anti-VEGF antibody，respectively；B：the semiquantitation for the band of STC2 was achieved by Quantity One software.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs IgG group.图6 在大鼠视网膜神经节细胞中VEGF与STC2存在相互作用

VEGF 信号通路在DR 过程中发挥着重要的作用［15-16］，越来越多的研究都发现VEGF 在糖尿病视网膜异常增生过程中发挥重要的作用，因此我们检测了DR 大鼠中VEGF 的表达变化，结果显示，DR 大鼠玻璃体中VEGF 的表达水平也显著升高。这一结果与以往的研究是一致的。我们进一步分析了玻璃体中VEGF 的分泌情况，发现DR 大鼠玻璃体润洗液中VEGF 的水平也显著增加。考虑到STC2 在DR 大鼠玻璃体的异常表达，本研究分析了STC2 与VEGF 在DR 大鼠玻璃体中的关系。Pearson 积矩相关分析显示，STC2 的 mRNA 水平与 VEGF 的 mRNA 水平呈非常明显的正相关关系，STC2 和VEGF 分泌蛋白的表达亦呈显著正相关相关，提示STC2 和VEGF 可能在DR过程中存在相互作用关系。

为了进一步探究在DR 过程中STC2 与VEGF 的相互作用关系，本研究利用大鼠视网膜神经节细胞分析 STC2 对 VEGF 以及 VEGF 对 STC2 的调节作用。首先，本研究发现VEGFA 能够在mRNA 和蛋白水平诱导STC2的表达，并且ELISA 的结果也说明VEGFA能够促进大鼠视网膜神经节细胞分泌STC2。而VEGF 在DR 过程中发挥着重要的作用，介导视网膜异常增生的过程，VEGF 可以促进STC2 的表达以及分泌水平，提示STC2极有可能是VEGF 信号通路的重要靶基因。分子间相互作用是体内分子功能调节的重要方面，因此本研究进一步分析STC2 对于VEGF 是否存在正反馈的调节。用STC2蛋白处理大鼠视网膜神经节细胞，发现STC2 能够诱导VEGF 的表达，说明在大鼠视网膜神经节细胞中STC2 和VEGF 存在正反馈的调节。免疫共沉淀结果则显示VEGF与STC2存在蛋白相互作用。

综上所述，本研究发现了STC2 在DR 大鼠玻璃体中的异常表达，并且STC2 的表达与视网膜病变相关分子VEGF 存在正相关的作用关系，并且体外细胞实验进一步阐明了STC2 与VEGF 存在正反馈调节。这表明STC2 可能在DR 过程中发挥重要的功能，可能成为DR 重要的分子靶点，这也为开发干预DR药物提供了理论支持。