茜素红S标记鳙耳石的效果及其在增殖放流中的应用

阙江龙，王生，万锦涛，李涵，贺刚，张燕萍

（江西省水产科学研究所，农业农村部湖泊渔业资源环境科学观测试验站，江西 南昌 330039）

目前，过度捕捞、环境污染、大型水利工程建设、江湖阻隔等因素的影响，内陆水域生态环境发生了重大改变，渔业资源严重衰退，甚至枯竭。增殖放流是渔业资源养护的重要手段，在增加水生生物种群数量的同时，维持了生态系统多样性，改善了水域生态环境[1]。但目前对放流效果缺乏系统评估，放流的后续管理及放流措施优化缺乏科学依据[2]。

标志放流是评价放流效果，掌握放流鱼群移动分布规律的重要途径。近年来应用较多的标志放流方法有切鳍法、挂牌法、金属线码标记及分子标记等。但这些方法或对鱼体损伤较大或操作复杂等，存在一定的局限性，不适用于内陆水域中高数量、小个体的鱼种标记放流。荧光标记技术是用荧光染料浸泡鱼类使染料沉积在鱼类耳石、鳞片等钙化组织上，产生在显微镜下可识别的荧光标记或着色点标记[3]。荧光染料标记方法简单、适用范围广，对标记对象损伤较小，可大规模操作[4]，在渔业研究中受到越来越多的关注[5]，已在日本银鱼Argyrosomus japonicus[6]、许氏平鲉Sebastes schlegelii[7]、1 龄虹鳟Oncorhynchus mykiss 幼鱼[8]、中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis[9]、滇池金线鲃Sinocyclocheilus grahami[10]、长臀鮠Cranoglanis bouderius[11]和珊瑚鱼[12]等多种鱼类中研究应用，取得了一定成效。

鳙Aristichthys nobilis（又叫胖头鱼、花鲢）为中国特有，分布水域范围很广，是池塘养殖及水库渔业的主要养殖对象的大宗淡水产品之一，经济价值极高。鳙鳃耙结构独特，滤食浮游动植物能力较强，对氮、磷去除效果较好[13]，利用鳙治理水域富营养化，改善生态环境取得一定成效[14，15]。以江西省为例，仅2017—2018 年度放流的鳙夏花、冬片达1.1亿尾。由于未开展规范的效果评估，全省范围内大规模的放流对渔业资源恢复效果及水生态环境的修复程度不能做出科学的答复，也不利于后期放流方式的完善。本文利用茜素红S 溶液浸泡标记鳙幼鱼，观察其对鳙耳石的标记效果，寻找最佳标记浓度和浸泡时间等，以期为大规模增殖放流中个体识别及效果评价提供技术支持和依据。

1 材料和方法

1.1 材料

20 日龄鳙幼鱼（500 尾）来自江西省水产科学研究所黄马基地，在盛有曝气48h 的自来水玻璃缸中暂养1d。试验用茜素红S 分子式为C14H7NaO7S，中文别名为茜素磺酸钠；茜素S；茜素红S；茜素胭脂红；1，2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 方法

茜素红S 浸泡液浓度和浸泡时间见表1，设定5 个茜素红S 标记浓度：50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L 和250 mg/L 和一个空白对照组。试验在透明的的玻璃水族箱中进行（长30cm×宽30cm×高30cm），开始时随机在各浓度溶液中加入25 尾鳙鱼，浸泡过程中向水体中充气，浸泡结束后将幼鱼捞出，在流动清水放置半小时，最后放入清水中暂养并恢复投饵。

耳石的摘取和测定：将鱼置于Mshot 解剖镜（MD50）下，用解剖镊子和解剖针快速取出耳石，蒸馏水洗涤，95%乙醇脱水，光学显微镜下观察标记效果，并拍照。按照无（-）、可见（+）、明显（++）、强烈（+++）记录耳石荧光反应强度[16]。

耳石生长测定：将200 尾鳙在100mg/L 茜素红S 溶液中浸泡24h，放入网箱中饲养，每周在Mshot解剖镜（MD50）下取耳石，测量耳石中心距边缘短径的长度，计算耳石的生长。

2 结果与分析

2.1 茜素红S 标记的安全浓度

由表1 可知，当茜素红S 溶液浓度在50～150 mg/L、水温25～28℃、浸泡时间8～24h 时，鳙幼鱼成活率为100%，当浓度升至200mg/L 时，鳙幼鱼全部死亡。

2.2 标记效果

表1 茜素红标记方案和标记效果Tab.1 Alizarin red labeling scheme and labeling effect

可见光下，解剖镜下观察茜素红溶液浸泡标记的鳙耳石，可见紫红色标记环带，标记强度与浸泡浓度和浸泡时间有关。对照组中，经清水浸泡的鳙耳石呈透明灰质（图1）；8h 浸泡时间下，各浓度茜素红溶液中的耳石均可见明显的标志颜色（图2）。24h 时，50mg/L 浓度组中耳石标记颜色明显（图3），当浓度达到100 mg/L 和150mg/L 时，耳石标志颜色非常强烈（图4、图5）。当染料浓度达到200 mg/L 和250mg/L，鳙仔鱼全部死亡。

在24h 时，试验组中鳙幼鱼分别暂养1d 和7d后提取耳石观测（图3～图5），发现暂养7d 鳙耳石染色边缘已沉积了新的透明状生长轮，说明耳石随着饲养天数的增加而增长。

2.3 鳙饲养周数与耳石生长的关系

在13 周连续提取饲养鳙的耳石中，发现耳石上的荧光物质在光学显微镜下依然清晰。耳石长度（L）和相应的饲养周数（W）呈直线相关式：L=23.869W+16.555（R2=0.9554，n=37），二者存在一一对应关系。

3 讨论

3.1 鳙最佳荧光染料

渔业浸泡标记常用的荧光染料有盐酸四环素、钙黄绿素、茜素络合物和茜素红S 等。盐酸四环素是一种化学染料和处方药，具有一定毒性。欧阳斌和常剑波[17]用它标记稀有鲫Gobiocypris rarus，致死率极高，各浸泡浓度组均全部死亡。付自东等[18]利用盐酸四环素浸泡胭脂鱼Myxocyprinus asiaticus仔、稚鱼的耳石，标记效果很差；当浓度150mg/L时，有较高的致死作用。

许莉佳[19]利用钙黄绿素标记斑马鱼Danio rerio稚鱼耳石，表明钙黄绿素的绿色荧光与稚鱼耳石的自发荧光颜色相近，不容易区分，标记不显著，标记率低。李敏达等[20]用钙黄绿素标记翘嘴红鲌Culter alburnus 稚鱼效果较差。刘岩等[21]利用钙黄绿素浸泡黑鲷Acanthopagrus schlegelii 不能形成类似的肉眼可见标记痕迹，仅在荧光显微镜下可见。

茜素红S 在翘嘴鲌[20]、黑鲷[21]和中华倒刺鲃[26]中标记效果理想。茜素红S 毒性低，本文浓度达150mg/L 时，鳙稚鱼全部成活；染色的鳙耳石不需荧光显微镜，在普通光学显微镜下就能检出，且效果强烈。

综上所述，四种常用荧光染料中，盐酸四环素具有一定毒性，标记物的成活率低；钙黄绿素与鱼类的自发荧光颜色相近；茜素络合物标记物在可见光下达不到强烈效果。茜素红S 价格低廉，毒性低，低浓度对鳙无损害，在普通光学显微镜下就能检测到强烈标记，为大规模增殖放流提供了一种简捷、实用、有效的标记方法。

3.2 最适染色条件

不同鱼类对化学染料的耐受性和敏感性不同，因此，最适染色条件也不同[27]。本试验发现，在一定浓度条件下，延长浸泡时间，对鱼类没有显著的致死，8h 染色能见明显的标记环，24h 具有极强的染色效果。24h 染色时常优于8h，在100mg/L 浓度内，浓度越高，染色越深，高于150mg/L，耳石染色未见明显的加深，当浓度达到200mg/L，鳙致死。因此，在鳙放流中，100mg/L、24h 为最佳的浸泡染色条件。

3.3 茜素红S 在增殖放流中的应用

在增殖放流效果评估中，标记持续时间较短是荧光染料的主要缺点，目前对荧光标记的研究主要集中在即时染色效果，对染色结果长周期追踪较少。宋昭彬等[16]观察发现，第15 日还可观测到标记环；赵亚鹏等[10]利用茜素红及茜素络合物标志滇池金线鲃，记录的持续时间分别为27 日和26 日。邱晨等[28]利用茜素络合物标记鲤Cyprinus carpio 仔鱼，浸泡50d 后还可见标记环。本文每周镜检染色鳙耳石，长达90d（13 周）（图6），在普通光学显微镜下还可清晰看见标记色，说明ARS 标记所形成的标记环在耳石上可长期保存，延长了在增殖放流中跟踪监测的时间。

随着个体的生长发育，耳石不断增长，自无须鳕Merluccius bilincanis[29]被证实存在生长轮以来，鳡Elopichthys bambusa[16]、黄线狭鳕Theragra chalcogramma[30]、大麻哈鱼Oncorhynchus keta[31]、月鳢Channa asiatica[32]等鱼类耳石陆续被确证。本研究表明，鳙稚鱼的生长与耳石的长度呈显著的线性关系（图6）。据此，测量回捕标志鱼的耳石长度，可以准确推算放流时间和批次，为研究放流鱼早期生活史阶段生态习性提供了便利，为增殖放流中有效使用标记技术提供了理论和技术支持。