产NDM-5大肠埃希菌的鉴定及特征分析

付魏萍， 袁 翊， 张禄滑

(1.内江市第二人民医院 检验科，四川 内江 641000；2.内江市第一人民医院 检验科，四川 内江 641000；3.西南医科大学基础医学院 病原生物学教研室，四川 泸州 646000)

碳青霉烯类抗生素常常被认为是治疗超广谱β内酰胺类耐药肠杆菌科细菌感染最为有效的药物[1]。然而，由于该类药物的大量使用，碳青霉烯类耐药细菌也不断出现，给全球公共卫生安全造成了极大的威胁[1]。这些细菌能够产生不同种类的碳青霉烯酶，其中新德里金属β内酰胺酶(NDM)是新近发现的对临床影响较大的一种酶。NDM-1是2008年在印度被首次发现的，之后便迅速蔓延全球[2]。到目前为止，已报道24种NDM突变体[3]。除单环β-内酰胺类抗生素外，NDM能有效水解几乎所有β-内酰胺类抗生素，包括碳青霉烯类抗生素，给临床治疗带来巨大挑战[3]。NDM-5被首次报道是2011年，在1株多重耐药的大肠埃希菌(Escherichiacoli)中检测到[4]，和NDM-1相比，NDM-5中有两个氨基酸位点发生了替换(Val88Leu和Met154Leu)，这种替换使NDM-5有了更强的水解β-内酰胺类抗生素的能力[4]。目前，NDM-5已在多个细菌物种中被检测到，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、变形杆菌等[3]。本研究从临床病人血液标本中分离到1株产NDM-5的大肠埃希菌，该菌株对多种抗菌药物耐药。结合高通量测序和生物信息学分析技术，对该菌株的基因组特征、耐药质粒特征进行了分析，以期为临床耐药菌株感染的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 大肠埃希菌(Escherichiacoli)SCNJ06分离自一位急诊科68岁男性发热患者的血液标本，-80 ℃保存备用。

1.1.2 培养基 ①胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)；②胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购自北京索莱宝科技有限公司；③LB培养基。

1.1.3 主要试剂 美罗培兰、黏菌素和叠氮化钠等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；2×TaqMaster Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.1.4 仪器与设备 t100 PCR仪和GelDocXR+凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；Micro21R高速低温离心机购自美国Thermo公司；Vitek-2 compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统购自法国生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定与药敏试验 首先通过Vitek-2 compact全自动微生物分析系统对菌株SCNJ06做初步鉴定，再对其进行16S rRNA基因测序鉴定。16S rRNA基因的扩增及测序鉴定采用通用引物27F和1492R[5]。为了查明该菌株中碳青霉烯耐药基因的存在情况，采用PCR方法对blaKPC、blaNDM、blaGES、blaMP、blaOXA-48和blaVIM耐药基因进行了检测，检测引物及方法参照文献[5]。采用Vitek-2 compact全自动微生物分析系统测定药物敏感性，药物包括头孢吡肟、妥布霉素、环丙沙星、复方新诺明、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、头孢替坦、头孢曲松、头孢唑林、呋喃妥因、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星和头孢他啶。美罗培南和黏菌素对该菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)通过微量肉汤稀释法进行测定[6]。黏菌素的判断点根据欧洲抗菌素敏感性试验委员会的标准执行(http://www.eucast.org/)，其他药物的判断点根据临床实验室标准化委员会制定的标准执行(CLSI，2019)。

1.2.2 接合试验 参照文献[7]，采用肉汤进行细菌接合，受体菌为大肠埃希菌J53(叠氮化物耐受)。接合转化子涂于含有叠氮化钠(150 μg/mL)和美罗培南(2 μg/mL)或阿米卡星(30 μg/mL)的LB平板进行筛选。PCR方法鉴定转化子中blaNDM或rmtB基因[8]。

1.2.3 基因组测序及分析 使用快速细菌基因组DNA提取试剂盒(Sangon Biotech, Shanghai, China)提取大肠埃希菌SCNJ06的总基因组DNA。纯化的DNA送诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序，测序平台为Illumina HiSeq 2000，测序方法为150 bp双端测序，测序深度大约150×。使用Trimmomatic软件去除Reads中接头序列和低质量序列[9]；使用SOAP denovo软件组装clean reads[10]；使用Prokka软件注释组装序列[11]；使用ANI Calculator (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)分析基因组的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)以确定其物种归属。通过the center for genomic epidemiology (http://genomicepidemiology.org/)中的ResFinder 3.2检测分析基因组中的耐药基因。菌株的序列型使用MLST 2.0(Multi-Locus Sequence Typing)分析(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)，使用SerotypeFinder 2.0软件(https://cge.cbs.dtu.dk/services/SerotypeFinder/)进行血清分型；使用在线软件PlasmidFinder 2.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)预测鉴定基因组中的质粒。基因组中毒力基因的鉴定使用在线软件VirulenceFinder 2.0预测(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)，进化群的测定参考文献[12]。从接合转化子中提取携带blaNDM或rmtB基因的质粒DNA，用相同的测序平台Illumina HiSeq测序。使用软件SPAdes[13]过滤掉大肠埃希菌J53细菌基因组序列后，对剩余reads进行拼接以获得质粒序列。质粒复制子型通过软件PlasmidFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)、MLST通过pMLST (https://cge.cbs.dtu.dk/services/pMLST/)进行分析。使用Prokka软件注释质粒序列，序列比对采用BLAST软件。pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06质粒全序列通过BRIG[14]进行展示。

1.2.4 核苷酸序列接收号 本研究的细菌基因组序列和质粒序列均上传至GenBank数据库，其中大肠埃希菌SCNJ06基因组序列接收号为WUBW00000000，pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06质粒序列接收号分别为MN865121和MN865122。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌SCNJ06的药物敏感性

经Vitek-2 compact微生物分析系统检测和16S rRNA基因测序鉴定表明，菌株SCNJ06为大肠埃希菌。Vitek-2 compact系统检测显示，SCNJ06对大多数测试药物均表现为耐受，其中头孢吡肟(MIC≥64 μg/mL)、妥布霉素(MIC≥16 μg/mL)、环丙沙星(MIC≥4 μg/mL)、氨曲南(MIC≥64 μg/mL)、哌拉西林-他唑巴坦(MIC≥128 μg/mL)、氨苄西林(MIC≥32 μg/mL)、氨苄西林/舒巴坦(MIC≥32 μg/mL)、阿米卡星(MIC≥64 μg/mL)、头孢替坦(MIC≥64 μg/mL)、头孢曲松(MIC≥64 μg/mL)、头孢唑林(MIC≥64 μg/mL)、庆大霉素(MIC≥16 μg/mL)、亚胺培南(MIC≥16 μg/mL)、左氧氟沙星(MIC≥8 μg/mL)和头孢他啶(MIC≥64 μg/mL)。但SCNJ06对呋喃妥因(MIC 64 μg/mL)表现为中介，对复方新诺明(MIC≤20 μg/mL)敏感。此外，微量肉汤稀释法检测显示，该菌对美罗培南(MIC≥256 μg/mL)耐药，对黏菌素(MIC≤2 μg/mL)敏感。

2.2 大肠埃希菌SCNJ06的基因组特征

大肠埃希菌SCNJ06的基因组草图包含4 894 965 bp，其GC含量为50.72%。该基因组草图组装成了99个contig，其中大于1 000 bp的有90个。细菌基因组ANI分析进一步证实了菌株SCNJ06属于大肠埃希菌，因为与大肠埃希菌参考基因组K-12 substr. MG1655相比，该菌株基因组的OrthoANIu值达到了99.56%，而这一值要显著高于判定一个细菌物种的临界值95%～96%[15]。

经ResFinder分析显示，SCNJ06含有7种类型的抗生素耐药基因，包括氨基糖苷类(rmtB、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id)、β内酰胺类(blaNDM-5、blaTEM-1B、blaCTX-M-55)、磷霉素类(fosA3)、氯霉素类(floR)、磺胺类(sul2)、四环素类(tet(A))和MLS类(mdf(A))(大环内酯类、林可胺类、链阳性霉素B。经PlasmidFinder分析显示，SCNJ06中含有3种类型质粒IncFII、IncN和IncX3，进一步分析显示，该菌株序列型为ST167(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA等位号为10-11-4-8-8-13-2)，血清型为H9:O8。大肠埃希菌SCNJ06属于进化群A菌株，主要包括3种毒力因子，capU(Hexosyltransferase homolog)、gad(Glutamate decarboxylase)和iss(Increased serum survival)。

2.3 pNDM5_SCNJ06质粒分析

接合试验显示，blaNDM-5基因能够从供体菌SCNJ06成功转入受体菌J53中。与J53相比，美罗培南对blaNDM-5转化子的MIC从0.5 μg/mL上升到了128 μg/mL。以上研究表明，blaNDM-5能够正常发挥其功能，并且携带blaNDM-5的质粒pNDM5_SCNJ06是一个可自发性接合转移的质粒。

pNDM5_SCNJ06长度为46 161 bp，其GC含量为46.65%，包含58个开放阅读框(图1)。ResFinder分析显示，该质粒仅含有1个耐药基因blaNDM-5，其编码产物NDM-5主要参与对碳青霉烯类抗生素耐受。PlasmidFinder分析显示，该质粒类型为IncX3。通过将pNDM5_SCNJ06全序列和GenBank数据库进行BLAST比对分析发现，该质粒和最近报道的1个质粒pNDM-5(GenBank接收号CP043333)完全匹配(100%的相似性和覆盖率)。该质粒来源于1株奇异变形杆菌，是从杭州的一个病人尿液中分离到的。此外，该质粒和其他一些质粒也有很高的相似性，例如pEC135(GenBank接收号MH347484，100%的覆盖率和99.98%的序列相似性，该质粒来源于大肠埃希菌)和pNDM_MGR194(GenBank接收号KF220657，100%的覆盖率和99.98%的序列相似性，该质粒来源于肺炎克雷伯菌)。

图1 pNDM5_SCNJ06 与其他3 个类似质粒的比较Fig.1 Alignment of pNDM5_SCNJ06 with 3 other similar plasmids质粒的比较分析使用 BRIG 软件，pNDM5_SCNJ06 作为参考质粒，最外环表示参考质粒的注释信息The alignment was performed using BRIG and pNDM5_SCNJ06 was used as a reference，the outer circle denotes annotation of the reference plasmid

2.4 prmtB_SCNJ06质粒分析

接合试验表明，rmtB基因能够从供体菌SCNJ06转入受体菌J53。同时，药敏试验显示，与J53相比，rmtB转化子对阿米卡星的敏感性发生了显著的变化，从16 μg/mL变化为256 μg/mL。以上试验表明，prmtB_SCNJ06可自发性发生接合转移，同时rmtB基因能正常介导氨基糖苷类抗生素耐药。

prmtB_SCNJ06质粒包含89 602个核苷酸碱基对，其GC含量为53.38%，包含106个开放阅读框(图2)。该质粒类型为IncFII，其序列型为F33∶A-∶B-，包含多个耐药基因rmtB、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、blaTEM-1B、blaCTX-M-55、fosA3、floR、sul2和tet(A)。BLAST分析显示，prmtB_SCNJ06和多个质粒有较高的相似性和序列覆盖率，如pSCKLB555-3(GenBank接收号CP043935，覆盖率98%和相似性99.60%，该质粒来源于肺炎克雷伯菌)、pHNZY32(GenBank接收号MG197502，覆盖率98%和相似性99.95%)、pHNAH24(GenBank接收号MG197495，覆盖率98%和相似性99.95%，来源于大肠埃希菌)和pEF02(GenBank接收号CP040807，覆盖率98%和相似性99.61%，该质粒来源于费格森埃希菌)。

3 讨 论

随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，产NDM的肠杆菌科细菌也在大量产生，给全球公共卫生安全造成了极大威胁[16-17]。然而，问题还不仅如此，在携带blaNDM耐药基因的同时，同一株菌还可能同时携带多种其他种类的耐药基因，从而对多种类型抗菌药物耐药，使临床可供选择的治疗方案变得更加局限。因此，开展NDM流行病学调查对临床感染的防控具有重要意义。本研究从临床样本中分离出1株碳青霉烯耐药细菌，经微生物分析系统检测、16S rRNA基因测序以及基因组测序分析，均表明该菌株为大肠埃希菌。药敏试验显示，该菌株除对碳青霉烯类抗生素耐药，还对检测的其他类型抗菌药物如头孢类、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药，但对黏菌素和复方新诺明敏感，表明该菌株为多重耐药菌。再结合PCR检测及测序分析，表明该菌株是一株产NDM-5的多重耐药大肠埃希菌。

图2 prmtB_SCNJ06 质粒的遗传结构Fig.2 Genetic structure of plasmid prmtB_SCNJ06从内向外显示的是该质粒的 GC 含量和 GC 偏移，最外环表示该质粒的注释信息GC content and GC skew are indicated from the inside out，the outer circle denotes annotation of the plasmid

SCNJ06含有11个耐药基因，包括7种类型，主要是氨基糖苷类和β内酰胺类，各含有3个耐药基因，剩余5个分别属于磷霉素类、氯霉素类、磺胺类、四环素类和MLS类。其中，耐药基因谱与药敏结果不一致主要有以下两点：①药敏结果显示该菌对喹诺酮类耐药，但并没有检测到相关耐药基因，可能原因是该菌具有其他的耐药机制；②虽然检测到磺胺类耐药基因sul2，但该菌对复方新诺明仍表现为敏感，表明该基因仍不足以抵抗该复方制剂的抑菌作用。进一步分析发现，11个耐药基因中，除blaNDM-5位于质粒pNDM5_SCNJ06上，MLS类耐药基因mdf(A)位于染色体上，其余9个均位于质粒prmtB_SCNJ06上。以上结果表明，耐药基因主要位于质粒上，借助质粒的可传递性，耐药基因便很容易地传播给其他细菌，引起更广泛的耐药。该菌株序列型为ST167，通过文献查阅发现，国内产NDM-5的ST167大肠埃希菌于近期相继报道[18-20]，表明了该类型菌株在国内的广泛流行性。

序列比对分析发现，blaNDM-5携带质粒pNDM5_SCNJ06和国内所报道的多个IncX3质粒在序列上有高度的一致性，如分离自浙江的pNDM-5和pEC135，分离自山东的pNDM-QD28和pNDM-QD29。此外，该质粒还与分离自其他国家的IncX3质粒有高度一致性，如分离自印度的pNDM-MGR194，而pNDM-MGR194类似质粒在多国相继被报道，如澳大利亚、丹麦等[18]。以上研究表明，pNDM-MGR194类似质粒具有世界流行性的特点，同时该类型质粒对blaNDM-5耐药基因的传播发挥着重要作用。prmtB_SCNJ06含有菌株SCNJ06大多数耐药基因，与pNDM5_SCNJ06一起赋予该菌株更广泛的耐药谱。序列比对分析发现，prmtB_SCNJ06和多个质粒在序列上有高度的一致性，如pSCKLB555-3、pHNZY32、pHNAH24和pEF02，它们分离自不同的细菌，包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和费格森埃希菌，表明该类型质粒可以跨越种属限制而自由传播，同时还发现这种类型质粒可以分离自不同的样本，包括人和动物，进一步说明了该类型质粒传播的广泛性。

本研究鉴定的ST167型多重耐药大肠埃希菌SCNJ06，主要携带两种自转移性耐药质粒pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06，分别介导blaNDM-5和rmtB等多种耐药基因的传播。blaNDM与其他多种耐药基因的共存与传播给人类健康造成了巨大威胁，有必要加大对该领域的流行病学调查，为临床感染性疾病的综合防控提供参考。