嗅素蛋白4对卡介苗诱导巨噬细胞凋亡和细菌胞内生存率的影响

王启源， 姬文兰， 虞秀锋

（陕西省结核病防治院内四科，陕西 西安 710100）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种人畜共患传染病。MTB是一种典型的胞内致病菌，可通过多种不同机制逃逸机体免疫细胞的杀伤及清除，从而在宿主细胞内进行复制和繁殖，并长期在机体内存活。巨噬细胞是宿主抵御MTB感染的第一道防线，也是控制其复制和繁殖的关键效应细胞[1]。MTB侵入机体感染宿主后诱导巨噬细胞凋亡，从而激活巨噬细胞抗结核免疫机制，抑制其在体内扩散，增强机体的免疫杀伤能力[2-3]。此外，细胞凋亡可作为细胞内MTB的防御机制，降低其生存能力，研究巨噬细胞的凋亡可进一步明确MTB的致病机制，已成为近年来的研究热点。

嗅素蛋白4（olfactomedin，OLFM4），是嗅觉介导素蛋白家族成员之一，编码510个氨基酸，属于分泌型糖蛋白，广泛分布于骨髓、小肠、结肠和胰腺等器官。有研究报道，OLFM4通过多种机制参与细胞凋亡、增殖和分化等进程，在抗细菌感染先天免疫、胃肠道炎症及癌症中发挥着重要作用[4]，可能成为这些疾病的潜在治疗靶点。有研究结果表明，OLFM4在幽门螺杆菌感染患者中上调，且通过调控NF-κB通路参与宿主对幽门螺杆菌感染的先天免疫[5]。此外，OLFM4缺失的小鼠通过上调组织蛋白酶C和下游蛋白酶活性增加了嗜中性粒细胞对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀伤[6]。在小鼠中性粒细胞中，OLFM4缺失抑制H2O2诱导的还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADPH）氧化酶活性及凋亡，表明OLFM4可作为治疗炎性疾病的潜在靶点[7]。然而OLFM4在卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）诱导的巨噬细胞中的作用机制尚不明确。本研究通过采用BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7建立稳定的MTB感染巨噬细胞模型，探讨OLFM4对BCG诱导的巨噬细胞凋亡及其对BCG在巨噬细胞中存活的影响，以期阐明其对巨噬细胞抗BCG感染的免疫调控机制，为治疗TB寻找新靶点。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

小鼠RAW264.7巨噬细胞株（中国科学院上海市生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所），BCG菌株（上海生物制品研究所有限公司），DMEM培养基和胎牛血清（美国Hyclone公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR Green试剂盒和Cell Death Detection ELISA Kit（德国Roche公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher公司），硝酸纤维素膜（polyvinylidene fluoride membranes，PVDF）和增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（美国Millipore公司），OLFM4、Bax、Bcl-2和β-actin抗体（美国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养 将RAW264.7细胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素以及100 mg/L链霉素的DMEM培养液中，37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，每1～2 d传代1次。

1.2.2 BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7 当RAW 264.7细胞稳定后长至70%～80%时，按照感染复数为10∶1接种BCG菌悬液，摇匀后置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育。4 h后弃上清，以预温的DMEM培养液洗涤2次，去除未感染进入细胞内的细菌，更换新鲜培养液，作为细胞感染的0 h。分别于BCG感染巨噬细胞0、12、24、48 h时检测各组OLFM4的表达水平。

1.2.3 细胞转染 将巨噬细胞RAW264.7（1×105个/孔）接种于12孔板，待细胞汇合度达到50%，采用Lipofectamine 2000试剂将si-OLFM4及阴性对照（si-NC）转染到RAW264.7细胞，按照说明书进行操作。转染24 h后，采用实时荧光逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerasechain reaction，RT-PCR）及免疫印迹法验证转染是否成功。

1.2.4 RT-PCR检测mRNA表达水平 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并检测核酸浓度。将细胞总RNA逆转录成cDNA。采用SYBR Green试剂盒通过ABI Prism 7900实时定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）检测目标mRNA的表达水平。以β-actin为内参照，根据2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量。

1.2.5 免疫印迹法检测蛋白表达 收集各组细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。50 μg总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDSPAGE）电泳分离，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入相应一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL化学发光显影，拍照；用ImageJ分析各个条带的吸光度值。计算目的蛋白与β-actin灰度值的比值，并进行统计学分析。

1.2.6 酶联免疫吸附试验检测细胞凋亡 将RAW264.7细胞5×105个/mL接种于6孔板培养皿中，采用酶联免疫吸附试验检测巨噬细胞凋亡。

1.2.7 BCG生存力检测 采用平板菌落计数法检测BCG生存率，细菌感染4 h后，用不含血清的DMEM洗涤，除去未被吞噬的细菌。在培养板中再加入完全DMEM培养液1 mL继续培养。分别于感染后24和48 h弃去培养液，每孔加入500 μL 0.5%Triton X-100裂解细胞，待细胞全部裂解后加入500 μL完全培养液终止裂解。震荡混匀5 min，将稀释后的裂解物分3份接种于含油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶（oleicalbumindextrosecatalase，OADC）的7H11琼脂平板上，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养3周后进行菌落计数。使用标准程序重复3次计算细菌菌落数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5软件进行数据分析和作图。数据以x±s表示，2个组间比较采用t检验，多组数据采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OLFM4在BCG诱导的巨噬细胞RAW264.7中的表达

RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示，OLFM4在BCG感染的RAW264.7细胞中明显上调，并呈时间依赖性；RAW264.7细胞转染si-NC和si-OLFM4结果显示，转染si-OLFM4后，OLFM4mRNA和蛋白表达的水平显著下降。见图1。

图1 OLFM4在BCG诱导的巨噬细胞RAW264.7中的表达

2.2 OLFM4对BCG诱导的巨噬细胞凋亡的影响

酶联免疫吸附试验结果显示，BCG感染的RAW264.7细胞凋亡率明显升高，而OLFM4沉默显著降低BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡。进一步检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平，结果显示，BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中，抑凋亡蛋白Bcl-2显著下调，同时促凋亡蛋白Bax明显上调，而沉默OLFM4显著逆转BCG介导的Bcl-2和Bax蛋白的表达。见图2。

图2 OLFM4沉默抑制BCG诱导的巨噬细胞凋亡

2.3 OLFM4对巨噬细胞RAW264.7中BCG存活率的影响

平板菌落计数结果显示，OLFM4沉默后RAW264.7感染24和48 h的BCG的存活率明显升高，提示沉默OLFM4能够抑制宿主对分枝杆菌的防御作用。见图3。

2.4 沉默OLFM4阻断BCG介导的TLR2/NF-κB信号通路

为探讨OLFM4对BCG诱导的巨噬细胞凋亡的调控机制，我们检测了OLFM4对TLR2/NF-κB信号的影响，结果显示，OLFM4抑制BCG诱导的p-p65和TLR2的表达水平下调，而总p65表达水平不变，提示OLFM4沉默可抑制BCG介导的TLR2/NF-κB信号通路。见图4。

图3 OLFM4沉默促进胞内BCG存活

图4 沉默OLFM4抑制BCG诱导的TLR2/NF-κB通路

3 讨论

MTB存在于被感染宿主巨噬细胞内，可通过多种机制调控巨噬细胞凋亡，而这种调控与其在宿主细胞内的生存密切相关，影响TB的发生、发展。有研究发现，细胞凋亡是杀死MTB的重要途径[8-9]，OLFM4可调节宿主对各种细菌感染的先天免疫[5-6]。本研究发现，OLFM4在BCG感染的RAW264.7细胞中明显升高，BCG感染引发RAW264.7细胞凋亡，而沉默OLFM4能够抑制BCG诱导巨噬细胞凋亡，并下调促凋亡蛋白Bax表达水平，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，从而抑制BCG诱导的巨噬细胞凋亡。

巨噬细胞作为MTB的主要宿主细胞和靶细胞，二者之间的相互作用较为复杂。细胞凋亡是巨噬细胞杀死MTB的必要条件，而强毒性的MTB可抑制细胞凋亡而诱发坏死，促进细菌逃逸进入周围组织开始新的感染周期，最终导致MTB传播。MTB主要在巨噬细胞等宿主免疫系统的细胞内存活和繁殖。本研究结果显示，OLFM4沉默能够增强MTB的存活率，促进MTB在巨噬细胞内的生长。OLFM4沉默在BCG感染机体的过程中通过抑制巨噬细胞凋亡参与宿主与BCG的相互作用，这为TB的防治提供了一定的理论基础，可以帮助开辟一条新的治疗途径。

在MTB感染过程中，巨噬细胞中的多个分子及其相关信号通路参与了巨噬细胞凋亡的调控，对凋亡相关机制的研究将有助于阐明TB的发病机制，并为其防治提供新的思路。NF-κB在先天性免疫系统及适应性免疫应答中具有重要作用，而且MTB感染能够激活NF-κB信号通路[10-11]。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是先天免疫的关键效应分子，能够与一些病原体特异性配体结合，在宿主细胞中启动信号转导通路，并激活NF-κB诱导细胞因子及病原体的适应性免疫反应[12]。TLR2在MTB感染的典型免疫应答过程中具有重要作用[13]。有研究报道，NF-κB依赖的基因转录能够被分枝杆菌BCG或是巨噬细胞中TLR2的分枝杆菌配体调节从而产生大量的细胞因子[14]。本研究发现，下调OLFM4能够降低p-p65和TLR2的表达，从而抑制TLR2/NF-κB通路的活性，提示TLR2/NF-κB通路参与了OLFM4调节致病性细菌BCG感染的免疫应答进程。

OLFM4沉默可抑制BCG感染的巨噬细胞凋亡，从而增强BCG存活率，其机制可能是通过TLR2/NF-κB信号通路实现，后续我们拟构建TB感染动物模型，进一步从体内证实OLFM4在机体抗BCG感染过程中的免疫调控作用与机制，为进一步研究BCG感染的致病机制提供新的思路，并为研制TB治疗药物提供新靶点。