血清醛固酮候选参考测量程序的建立及性能评估

邹继华， 李全乐， 沈 敏， 张 曼， 杨晓东， 屠敏敏， 冯东方， 孙宏娜

（1. 美康生物参考实验室，浙江 宁波 315104；2. 首都医科大学附属北京世纪坛医院检验科，北京 100038；3. 西藏军区总医院检验科，西藏 拉萨 850007）

醛固酮是人体内调节血容量的激素，通过调节肾脏对钠离子的重吸收，维持水盐平衡[1]。准确测定血清醛固酮对于原发性醛固酮增多症（primary aldosteronism，PA）的筛查、诊断和亚型评估至关重要[2]，血清醛固酮还可用于诊断肾上腺偶发瘤、肾上腺癌、艾迪生病、先天性肾上腺增生、肾脏动脉狭窄和肾小管通道病变[3]。因此，准确测定血清醛固酮水平对于正确诊断内分泌疾病至关重要。血清醛固酮水平一般为pmol级别，对检测方法的准确度和灵敏度有很高的要求。目前用于醛固酮测定的放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）和化学发光免疫分析法存在缺乏特异性、基质效应及分析物动态范围有限等问题[4-5]。因此，需要一种更加灵敏、准确的方法来获得可靠的检测结果。气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[6]和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7]是目前灵敏度和准确性最好的方法。在测定类固醇激素时，GC-MS的样本前处理需要进行复杂的衍生化，而LC-MS/MS的前处理步骤更加简便，耗时短，灵敏度高，更能满足临床需求。目前，检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列出了2种血清醛固酮参考方法[6，8]，分别由德国临床化学学会和比利时根特大学建立，均采用GC-MS，以同位素稀释质谱法为测量原理，样本前处理时需要衍生化，操作繁琐，分析时间长。本研究拟采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法（isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS），以液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）方式进行样本前处理，建立测定血清醛固酮的候选参考方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX QTRAP 5500液相色谱串联质谱（美国SCIEX公司）、Thermo Hypersil BDS C18柱（100 mm×2.1 mm，粒径2.4 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Eppendorf移液器（德国Eppendorf AG公司）、Milli-Q超纯水系统（德国Millipore公司）。

醛固酮标准品[纯度≥99%，浓度为（106.4±0.1）μg/mL]和内标醛固酮-2H7[纯度≥98.85%，浓度为（102.9±0.1）μg/mL，同位素丰度为98%]均购自美国Iso Sciences公司。无水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇均为色谱级，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 标准品制备 采用重量法配制醛固酮和醛固酮-2H7标准溶液，用乙醇稀释，分别制备成674.77 ng/g醛固酮标准储备液和653.63 ng/g醛固酮-2H7储备液。进一步用乙醇稀释醛固酮标准储备液，分别制备出浓度为1.345 26 ng/g的醛固酮标准工作液1，浓度为0.363 85 ng/g的醛固酮标准工作液2以及浓度为0.758 16 ng/g的醛固酮-2H7工作液。配制的溶液-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 样本前处理 移取0.25 mL内标工作液至5 mL离心管并用天平称重，加入血清之前将溶剂吹干以避免蛋白沉淀。准确称取0.5 mL血清样本，加入已吹干的5 mL离心管中。样本和内标在室温条件下温和振荡平衡10 min。然后加入2.5 mL甲基叔丁基醚，振荡10 min，2 560×g离心3 min后吸取上清液至新的5 mL离心管中。将萃取物在35 ℃条件下用氮气吹干，再加入200 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液复溶，混匀，13 000×g离心5 min，取150 μL上清，加入进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为纯水，流速为0.3 mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL。梯度洗脱（0→4 min，30%A→60%A；4→4.1 min，60%A→95%A；4.1→5 min，95%A；5→5.1min，95%A→30%A；5.1→7 min，30%A）。

1.2.4 质谱分析条件 采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）负离子模式，离子化电压-4 500 V，雾化温度550 ℃，雾化气、辅助加热气和气帘气分别为40、55、15 psi。采用多反应监测模式扫描分析。见表1。

1.3 方法性能评估

1.3.1 标准曲线与线性评价 采用重量法通过向内标工作液添加不同质量的标准工作液制作9点标准曲线，使得标准与内标的质量比值范围为0.1～4.5，醛固酮的浓度范围为0.08～3.55 nmol/L。将标准和内标混合溶液在35 ℃条件下用氮气吹干，再加入200 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液复溶，混匀，转移到进样瓶中用于LC/MS/MS分析。每个浓度样本测定2次，取均值。各浓度的检测偏移＜15%，且r＞0.99可判断为呈线性[9]。

1.3.2 干扰评价 将16种与醛固酮结构类似的类固醇激素作为潜在干扰物进行评价。用50%（V∶V）甲醇水溶液配制高于正常生理浓度的类固醇激素溶液（浓度为500 nmol/L的皮质酮、皮质醇、睾酮、硫酸脱氢表雄酮、脱氢表雄酮、雌二醇、孕酮、可的松、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、雌酮、双氢睾酮和雄烯二酮），并采用ID-LC-MS/MS检测。若醛固酮保留时间（4.19 min）无色谱峰，则这些结构类似物对血清醛固酮定量不存在干扰。另外，为了评估其他潜在干扰，通过比较标准溶液和90份血清样本中醛固酮定性离子/定量离子（confirmation ion to quantitation ion，CI/QI）比值的平均值，若差异＜20%可判断为不存在影响血清醛固酮定量检测的潜在干扰[10]。

1.3.3 检测限与定量限（limit of quantitation，LOQ） 用已知浓度的血清样本（0.225 nmol/L）稀释得到3个浓度梯度的样本（编号为1、2、3），即预期LOQ限样本，分别计算每个浓度样本的浓度测定均值与理论浓度的偏差及精密度。LOQ要满足偏移＜20%、变异系数（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10，以RSN=3时的计算浓度值为检测限[9]。

1.3.4 精密度评价 测定3个批次低浓度（0.208 nmol/L）、中浓度（1.295 nmol/L）、高浓度（2.880 nmol/L）血清醛固酮，每个浓度样本重复测定5次，分别计算批内CV和批间CV。

1.3.5 准确度评价 通过加标回收和室间比对研究2种方式对方法的准确度进行评价。（1）加标回收实验：分别称量浓度为6.747 7 ng/g的醛固酮标准溶液0.05、0.25、0.5 mL，氮气吹干后分别加入已知浓度（0.362 nmol/L）的混合血清（B），采用重量法各加入3.5 mL，混匀，制备出3个浓度的加标样本，分别计算添加理论浓度（C），然后将各个浓度的加标样本（各6份）进行处理后进样检测，得到实际测定浓度（A），加标回收率（R）=（A-B）/C×100%。回收率应满足100%±10%。（2）室间比对研究：采用建立的ID-LC-MS/MS测定国际临床化学和检验医学联合会参考实验室外部质量评价计划（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）样本，对每个批次3份样本进行前处理，连续测定2个批次，将测量结果与RELA回报结果作偏移比较，偏移在±8.75%判断为可接受。

1.3.6 基质效应 采用基质混合实验的方法来评价相对基质效应，通过检测血清基质样本（A）、溶液基质标准溶液（B）、血清和溶液50∶50（质量比）混合物（C）、血清和溶液80∶20（质量比）混合物（D）、血清和溶液20∶80（质量比）混合物（E）这5种基质样本中标准与内标的峰面积比值来计算相对基质效应。1∶1混合物相对基质效应=[C-（A+B）/2]/[（A+B）/2]×100%；80∶20混合物的相对基质效应=[D-（0.8A+0.2B）]/（0.8A+0.2B）×100%；20∶80混合物的相对基质效应=[E-（0.2A+0.8B）]/（0.2A+0.8B）×100%。如果3种混合物计算得到的结果＜20%，则视为无相对基质效应[11-12]。

1.4 不确定度评估

依据《测量不确定度表示指南》（Guide to the Uncertainty in Measurement，简称GUM），测量结果的浓度计算公式为C=（A/A内标-b）/k×fc×fm，式中C为醛固酮的测定值（ng/mL）、A/A内标为样本与内标的峰面积比值、b为标准曲线截距、k为标准曲线斜率、fc为标准与内标溶液浓度修正因子、fm为样本处理修正因子。从标准工作液配制、样本处理、仪器检测及重复测量4个方面分析不确定度来源，并量化各个分量[9]。

2 结果

2.1 标准曲线和线性评价

纯溶液和血清样本中醛固酮标准和内标的色谱图见图1。标准曲线见图2，醛固酮在0.08～3.55 nmol/L范围内呈线性。

图1 醛固酮和醛固酮-2H7的色谱图

图2 ID-LC-MS/MS检测血清醛固酮的标准曲线

2.2 干扰评价

在醛固酮的检测条件下，16种类固醇激素在醛固酮保留时间（4.19 min）无干扰峰，在4.54 min出峰也能与醛固酮的峰基线分离，表明16种类固醇激素对血清醛固酮定量检测不存在干扰，见图3。标准溶液和血清样本中醛固酮CI/QI比值的平均值分别为0.71和0.69，偏移为2.3%，表明该方法不存在影响血清醛固酮定量的潜在干扰。见表2。

图3 类固醇激素和醛固酮标准的色谱图

表2 标准溶液和血清样本中CI/QI比值

2.3 LOQ和检出限

血清醛固酮的LOQ为0.045 nmol/L，检测限为0.012 nmol/L。见表3。

2.4 精密度评价

血清醛固酮低、中、高浓度的批内、批间CV分别为＜5.0%和＜4.1%，见表4。

表3 醛固酮的LOQ评估结果

表4 醛固酮的精密度评价结果

2.5 准确度评价

2.5.1 加标回收实验 血清醛固酮加标样本平均回收率为98.52%～100.14%，准确度满足要求，见表5。

2.5.2 室间比对研究 RELA-A和RELA-B样本醛固酮浓度测定结果的偏移分别为-0.22%和-1.53%，符合判断标准。见表6。

2.6 基质效应

3种混合物计算得到的相对基质效应分别为3.01%、3.52%和3.65%，均＜20%，表明基质效应是否存在并不影响目标分析物的准确定量。见表7。

表5 醛固酮加标回收率结果

表6 2018年RELA样本各实验室测定结果

表7 相对基质效应评估结果

2.7 不确定度评定

对3种不同浓度血清样本进行不确定度评定。3份血清样本的相对扩展不确定度分别为4.44%、5.36%和4.62%，见表8。3号血清样本的不确定度来源及数据分析结果见表9，其他2个编号血清样本的不确定度来源与之相同。

表8 3份不同浓度样本不确定度的评估结果

表9 3号血清样本的不确定度来源及数据分析表

3 讨论

GC-MS是目前测定类固醇激素公认的参考方法，但测定前必须先对样本进行衍生化，然后才能进行检测。与GC-MS相比，LCMS/MS具有许多优势，无需衍生化，样本制备更加简单。目前已有测定醛固酮的LC-MS/MS候选参考方法[1]，采用Sciex API Ⅲ质谱结合大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）电离得到的LOQ为0.042 nmol/L。但该参考方法使用的内标（氟美松）的保留时间与醛固酮的保留时间不同，因此基质成分可能会影响醛固酮和内标的反应。VAN DER GUGTEN等[3]采用API 5000质谱结合ESI电离负离子模式测定醛固酮的LOQ为0.05 nmol/L[3]。本研究的LOQ为0.045 nmol/L，与文献报道[3-4]基本一致。

离子抑制或增强是质谱方法分析生物样本中存在的一个主要问题。因此，本研究对基质效应进行了评估，结果显示相对基质效应为2.56%～3.62%。另外，血清样本中醛固酮和内标的保留时间为4.16～4.20 min，可与内源干扰物基线分离，能够帮助减小离子干扰。

本研究建立的ID-LC-MS/MS方法采用LLE将醛固酮从样本中萃取出来，经过纯化、浓缩后进入液相，反相色谱能有效保留醛固酮，将其与其他内源物质分离后，依次进入质谱仪，以减小对醛固酮的基质干扰。质谱分析采用电喷雾电离负离子模式及多反应监测模式同时检测母离子和子离子，通过2级离子扫描，排除大量干扰离子，使得质谱的化学背景降低，目标物的RSN显著提高，从而实现检测的高灵敏度和高特异性。目前使用的醛固酮萃取剂包括甲基叔丁基醚、二氯甲烷和二乙醚。本研究在预实验时比较了几种常见的有机萃取溶剂，包括二氯甲烷、二乙醚、甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯。从提取回收率结果看，二氯甲烷和甲基叔丁基醚效果最佳。二氯甲烷位于体系的下层，不易转移，甲基叔丁基醚位于体系的上层，更易操作。

本研究结果显示，采用建立的ID-LC-MS/MS方法测定血清醛固酮浓度，线性范围为0.08～3.55 nmol/L，检测限为0.012 nmol/L，LOQ为0.045 nmol/L，批内和批间CV分别为＜5%和＜4.1%，平均加标回收率为9 8.5 2%～100.14%，测定RELA样本的结果偏移＜1.6%。该法的灵敏度、精密度、准确度、特异性和抗干扰性能均符合参考测量程序的要求。

综上所述，本研究建立的基于ID-LC-MS/MS的血清醛固酮测定方法具有操作简单、准确性好、灵敏度高、特异性强等特点，有望成为测定血清醛固酮的参考方法。