3D数字PCR检测NSCLC患者血浆EGFR T790M基因突变的临床意义

袁世洋， 刘 川， 欧阳晓春， 谢军平， 贺荣芝， 李里香， 邹叶青

（1.福建医科大学附属南平第一医院重症医学科，福建 南平 353000；2.南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006；3.中国人民解放军联勤保障部队第908医院神经内科，江西 南昌 330009；4.南昌大学第二附属医院病理科，江西 南昌 330006）

最新全球癌症统计数据显示，肺癌占癌症发生率和死亡率的首位，分别为11.6%和18.4%[1]。肺癌按组织学分型可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占原发型肺癌的80%～85%[2]。近年来，针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因分子靶向治疗的快速发展虽然给具有EGFR敏感突变的NSCLC患者带来了福音，但是肿瘤治疗的耐受问题却不可避免。目前研究结果显示，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）获得性耐药机制中约60%由EGFRT790M突变引起[3]，而奥希替尼能使这类患者明显获益[4]。由此可见，在NSCLC患者接受EGFR-TKI靶向治疗的过程中，监管EGFRT790M突变对及时应用奥希替尼治疗是非常必要的。“液体活检”技术近年来倍受推崇，其中循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作为“液体活检”技术的“三驾马车”之一，更受研究者关注。有研究结果显示，晚期NSCLC患者血浆ctDNA中存在EGFRT790M突变，并能受益于奥希替尼治疗[5]。但血浆ctDNA的分子片段小、丰度低等特性给基因检测在临床中的应用带来了挑战[6]。本研究所采用的3D数字聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是在数字PCR的基础上，将混有样品和探针的PCR反应体系均匀分散至1张含有2万个ctDNA微孔的芯片上，形成2万个相互独立的微反应体系，每个微孔进行独立的PCR扩增，根据泊松分布的数学模型计算目标片段拷贝数。本研究以扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）作为参考标准，评价3D数字PCR检测血浆EGFRT790M基因突变的临床意义。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集2017年10月—2018年8月南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室被检测为初代EGFR-TKI耐药的70例NSCLC患者作血液标本及临床资料，编号后由2位实验人员分别采用ARMS和3D数字PCR对上述标本进行EGFRT790M基因突变检测。对于检测结果不一致的患者，及时反馈给临床医生，尽可能获取患者肿瘤组织标本进行验证。本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准，且患者知情同意。

1.2 仪器与试剂

7500 Real Time PCR Systerm、Proflex 2×Flat PCR System、3D数字PCR芯片阅读仪和3D数字PCR芯片装载仪购自美国Life Technologies公司；Qubit 3.0荧光计、ST16R台式高速离心机、台式低速离心机等购自美国Thermo Fisher公司。人EGFR基因突变检测试剂盒、石蜡组织切片DNA提取试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司；人EGFR基因T790M突变检测试剂盒、磁珠法核酸提取血浆游离DNA提取试剂盒购自天津诺禾致源科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血浆标本ctDNA提取 使用2支乙二胺四乙酸抗凝采血管，采集不少于15 mL全血，1 600×g离心10 min取上清，将取得的上清液于4 ℃、16 000×g离心10 min。把离心后的血浆分装到15 mL离心管中，加入20%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶K，混匀后于60 ℃孵育20 min。准备新的15 mL离心管，依次加入ctDNA结合液及ctDNA捕获磁珠，将孵育后的血浆置于冰上5 min，再将血浆加入刚准备好的离心管中，充分混匀。将离心管置于15 mL磁力架上5 min，直至磁珠完全被磁力吸附到同一侧，小心移出上清液，加入ctDNA漂洗液漂洗2次，80%乙醇漂洗2次，最后用50 μL ctDNA洗脱液洗脱，磁力架吸附后吸取上清，即为ctDNA。使用Qubit 3.0荧光计测定所提取ctDNA的浓度，并于-20 ℃保存备用。

1.3.2 肿瘤组织标本DNA提取 切取5～8片5 μm厚度的肿瘤组织放入1.5 mL离心管内，经脱蜡、脱苯处理后，使用石蜡组织切片DNA提取试剂盒提取DNA。使用Qubit 3.0荧光计测定所提取的DNA浓度，并于-20 ℃保存备用。

1.3.3 检测血浆EGFRT790M突变 （1）ARMSEGFR突变检测：使用人EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，具体操作按说明书进行；（2）3D数字PCR血浆EGFRT790M突变检测：样本稀释后取30 ng ctDNA原液，加入去离子水至体积为6.75 μL，加入T790M-M1 7.5 μL、T790M-M2 0.75 μL，使终体积为15 μL，微离心后充分混匀，用3D数字PCR芯片装载仪上样14.5 μL。PCR扩增程序：96 ℃ 10 min；62 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39个循环；10 ℃保持。用3D数字PCR芯片阅读仪读取芯片，并采用分析软件进行结果分析。

1.3.4 结果判读 ARMS检测结果的判读根据说明书进行（图1）。3D数字PCR检测结果的判读依据配套软件进行自动分析，即自动分析每个样本每个微滴的FAM和VIC的荧光信号，根据阳性微滴的比例自动获得PCR反应体系中起始模板DNA拷贝数浓度，并给出突变百分比，当突变百分比≥0.1时显示阳性（图2）。

图1 ARMS检测血浆EGFR T790M突变

图2 3D数字PCR检测血浆EGFR T790M突变

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用Kappa一致性检验和配对χ2检验比较ARMS和3D数字PCR检测患者血浆EGFRT790M结果的一致性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床特征

70例NSCLC患者中，男28例、女42例，年龄43～83岁，中位年龄62岁。所有患者均为晚期NSCLC，其中61（87.1%）例为腺癌。所有患者均接受EGFR-TKI靶向治疗，其中有58（82.9%）例选择了吉非替尼治疗。既往EGFR突变状态：41（58.6%）例为19-Del，27（38.6%）例为L858R突变。使用EGFRTKI靶向治疗后（检测时已明确肿瘤进展），EGFRT790M总突变率为48.6%，其中男性患者的EGFRT790M突变率为53.6%，女性患者为45.2%。见表1。

表1 患者一般临床特征 例（%）

2.2 3D数字PCR和ARMS检测血浆EGFR T790M基因突变结果比较

为了解3D数字PCR检测NSCLC患者血浆EGFRT790M突变的临床价值，我们把同一份血浆标本提取的ctDNA平均分为3份：1份用3D数字PCR检测；1份采用ARMS检测，并且将所得结果作为参考标准；另1份保存在-80℃冰箱用于复检。对2种方法检测结果不同的标本，及时反馈给临床医生，获取肿瘤组织标本进行验证。70份血浆标本中，ARMS检出T790M突变30（42.9%）例，3D数字PCR检出34（48.6%）例（表2）。采用Kappa一致性检验比较这2种方法检测患者血浆EGFRT790M突变结果的一致性，结果显示Kappa值为0.885（P＜0.001），表示2种方法诊断结果一致性良好。

表2 3D数字PCR和ARMS检测NSCLC患者血浆EGFR T790M突变的比较 例

有4例血液标本2种方法的检测结果不同，且ARMS检测结果均为EGFRT790M野生型。这4例患者中有3例进行了再次组织活检检测，1例拒绝。复检结果显示，ARMS检测这3例均为EGFRT790M突变。这些结果表明，3D数字PCR和ARMS一样可用于检测NSCLC患者血浆EGFRT790M突变，并且3D数字PCR还可以检测出ARMS所漏检的EGFRT790M突变患者。

3 讨论

EGFR基因是NSCLC的一个非常重要的驱动基因，基于EGFR突变机制及药物研究的快速发展，NSCLC的治疗方式发生了巨大转变。EGFR突变的NSCLC患者初代EGFR-TKI疗效显著，但仍在9～13月内不可避免地产生耐药[7]。目前已有研究报道了初代EGFR-TKI的众多获得性耐药机制，如EGFRT790M突变、MET基因扩增、ERBB2基因扩增、肝细胞生长因子过表达、PTEN基因失活等[8-9]，其中约有60%的EGFR-TKI的获得性耐药是由EGFRT790M突变引起的[3]。

目前，一般通过定期的胸部电子计算机断层扫描等影像学复查评价肿瘤治疗的有效性，但有研究结果显示，在疾病进展早期就可以在外周血中检测到EGFRT790M突变[10]。因此，在EGFR-TKI治疗过程中通过检测血液EGFRT790M突变对早期发现因EGFRT790M突变引起的耐药性也有着积极的临床意义。另一方面，血液标本比肿瘤组织样本采集更简便，且无创，患者的依从性更佳。

目前，已有多种半定量和定量基因分析平台被开发用于血浆EGFR基因分型检测，包括AMRS[11]、微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[12]以及下一代测序（next-generation gene sequencing，NGS）[13]等。ZHANG等[14]从311个研究中筛选出11个血浆EGFR基因检测法纳入系统进行分析，发现数字PCR检测ctDNAEGFRT790M突变的敏感性和特异性分别为70.1%和86.9%。THRESS等[15]使用4种方法（包括2种非数字法和2种数字法）检测血浆ctDNAEGFR突变，结果表明数字方法检测EGFRT790M突变具有更好的敏感性。

采用Kappa一致性检验比较ARMS和3D数字PCR检测患者血浆EGFRT790M突变结果的一致性，发现2种方法的一致性良好。此外，本研究对ARMS检测EGFRT790M为野生型而3D数字PCR检测EGFRT790M突变的4例患者中的3例再次进行肿瘤组织标本检测，结果证实此3例均为EGFRT790M突变表明3D数字PCR在具有较高敏感性的同时，也显示出了较好的特异性，可以检测出ARMS所漏检的EGFRT790M突变患者。这一观点与FENG等[16]的研究结果一致。

本研究尚存在一些不足之处：首先，我们并未对所有患者的肿瘤组织样本进行EGFRT790M突变检测，以更好地对ARMS和3D数字PCR检测血浆EGFRT790M突变的敏感性和特异性进行比较；其次，纳入的样本量相对较小，仍需要更大样本量的临床研究进行验证。总而言之，本研究认为3D数字PCR是一种高敏感性和特异性的新方法，适用于检测NSCLC患者血浆EGFRT790M基因突变。