丝氨酰tRNA 合成酶（SerRS）结合并激活去乙酰化酶SIRT2 的机制

秦懿偲 周德健 李超群 余 巍

（复旦大学生命科学学院微生物系 上海 200438）

赖氨酸乙酰化修饰是一种保守的、可逆的蛋白质翻译后修饰，参与调控许多细胞信号通路和疾病发病过程。乙酰化修饰通过改变赖氨酸残基上的电荷导致蛋白质构象变化，进而影响酶活、定位、DNA结合力和蛋白质稳定性［1-2］。蛋白质的赖氨酸乙酰化由赖氨酸乙酰基转移酶（lysine acetyltransferases，KATs）和赖氨酸去乙酰化酶（lysine deacetylases，KDACs）调 控。Sirtuins 家族是第Ⅲ类KDACs，它们的去乙酰化活性依赖于NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。SIRT2 作为Sirtuins 家族的成员之一，参与多种病理生理的发展过程，包括衰老［3］、能量限制［4-5］、细 胞 凋 亡［6］和 炎 症 反 应［7］等。研 究 显 示SIRT2 与心血管疾病的发病机制密切相关［8］。

氨酰tRNA 合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，AARS）是一个与蛋白质翻译紧密相关的古老的蛋白质家族，由20 种酶组成。这些酶通过识别对应氨基酸，使其与消耗ATP 的特定tRNA 连接起来，合成氨酰-tRNA，进而为最终蛋白质合成提供底物。且作为管家蛋白质，AARS 在漫长的进化过程中相当保守。近年来研究揭示了AARSs 在调控细胞生理活动时的新功能。例如，酪氨酰tRNA 合成酶可以作为白藜芦醇的靶点，在应激条件下，由细胞质转移至细胞核，影响DNA 损伤修复［9-10］；谷氨酰胺tRNA 合成酶可以同凋亡信号调节激酶ASK1 相互作用，进而对细胞凋亡产生影响［11］。在斑马鱼的遗传学研究中发现，丝氨酰tRNA 合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRS）可以通过调控血管生成中的关键调节因子——血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表达，进而在封闭血液循环系统的发育中发挥重要作用［12-14］。

研究表明，SerRS 可与SIRT2 相互作用，招募SIRT2 入核，且SerRS 与SIRT2 的相互 作用会 增强SIRT2 的去乙酰化活性［15］。但是，SerRS 与SIRT2作用的具体机制仍不清楚。本研究验证了SerRS能够与SIRT2 相互作用，并且增强其作用于底物α-微管蛋白（α-tubulin）的去乙酰化酶活性。通过对SIRT2 的H187 位 点 的 探 究，检 测 其 对SIRT2 与SerRS 结合的调控作用，同时通过结构模拟进行分析，为靶向SIRT2 的H187 位点治疗心血管疾病提供了新的方向和思路。

材料和方法

材料和试剂HEK293T 细胞来自本实验室，DMEM 高糖培养基购自美国HyClone 公司，SeryltRNA synthetase、SIRT2 和HA 抗 体 购 自 英 国Abcam 公司，α-微管蛋白及其K40Ac 抗体分别购自美国Invitrogen 公司和美国Proteintech 公司，FLAG和MYC 抗体则分别购于美国Sigma 公司和美国Cell Signaling Technology 公 司，Flag 磁 珠 购 自 德 国Sigma Aldrich 公司。KOD-plus 定点突变试剂盒购自日本东洋纺公司，烟酰胺购自美国Sigma 公司，BL21 感受态菌株购自上海擎科生物技术有限公司，质粒小抽试剂盒购自天根生物科技公司。

细胞转染HEK293T 细胞转染主要采用PEI试剂（以10 cm 培养皿为例）。在添加10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养HEK293T 细胞，当细胞密度达到60%～70%时，即可进行转染。将1 mL DMEM 培养基、5 μg 目的质粒及15 μL PEI 试剂依次加入1.5 mL EP 管中，反复吹打混匀，室温静置20 min。将EP 管内的混合液加入细胞培养基，摇匀，放入37 ℃恒温细胞培养箱中培养，6 h 后更换培养基，24～36 h 后回收细胞。

免疫共沉淀以10 cm 培养皿为例，除去细胞培养基，用4 ℃PBS 溶液洗涤3 次，加入预冷的1 mL 裂解液（提前加入蛋白酶抑制剂），将培养皿置于4 ℃水平摇床上，快速裂解20 min。结束后充分吹打，将裂解液收集到1.5 mL EP 管中，4 ℃下12 000×g离心30 min。取上清，转移到新的EP 管中。取64 μL 上清，加入16 μL 5×SDS 上样缓冲液，95 ℃加热15 min，用作细胞裂解样品（Input）。剩余上清中 加 入10 μL Flag 磁 珠，4 ℃旋 转3 h 或 过 夜。4 ℃下2 000×g离心2 min，去上清。加入1 mL 裂解液，混匀，4 ℃下2 000×g离心2 min，重复3 次。加入70 μL 1×SDS 上样缓冲液，95 ℃加热15 min，行Western blot 检测。

Western blot 检测向电解槽中加入适量电泳缓冲液后上样，80 V 恒压跑30 min，电压调至130 V跑1～1.5 h，样品前沿跑至最底端即可转膜，300 mA恒流湿转60 min。用5% BSA 溶液（M/V）室温封闭1 h。一抗孵育，4 ℃摇床过夜或室温摇床1 h。1×TBST 溶液洗膜5 min，重复3 次。加入HRP 标记的抗小鼠或抗兔的二抗，室温孵育1 h。1×TBST 溶液洗膜3 次，进行显影记录。

蛋白质纯化将目的片段克隆重组到pET28ahis 载体上，用重组质粒转化E.coliBL21。挑取成功表达质粒的单菌落到含有3～5 mL LB（含抗生素）的摇菌管中，37 ℃下培养至菌液浑浊，转移到含有1 L LB（含抗生素）的锥形瓶中进行扩增，37 ℃下培养 至D600为0.6～0.8，加 入 终 浓 度 为1 mmol/L 的IPTG 进行诱导，16 ℃下继续培养20 h。4 ℃下5 000×g离心20 min，收集沉淀细菌。

用缓冲液［200 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）+500 mmol/L NaCl+25 mmol/L 咪唑］重悬菌液，在4 ℃下使用流动泵将有His 标签的蛋白挂到提前平衡好的1 mL 镍柱上，用AKTA 将镍柱上的蛋白洗脱下来。浓缩分装，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

SIRT2 酶活检测酶活反应液配方为50 mmol/L Tris-HCl（pH=9.0）、4 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT、1 μmol/L MAL［Boc-Lys（AC）amc］和1 mmol/L NAD+。将纯化的野生型SIRT2 与SerRS 按照一定的摩尔浓度比加入上述反应液中，以MAL［Boc-Lys（AC）amc］为底物在37 ℃下进行反应。设置0、1、2、3 h 的反应时间梯度，加入与反应体系体积相同的停止液（含0.05 g/mL 胰蛋白酶）停止反应，并按照指示测量荧光强度（F360/F460）［16］。

结 果

SIRT2 与SerRS 在细胞内的相互作用我们通过免疫共沉淀实验来验证SIRT2 与SerRS 在细胞内的相互作用。因为SIRT1 定位于核内，且被证明可以促进血管生成［17］，所以我们同时验证了SIRT1是否可以在细胞内与SerRS 结合。 首先在pCDNA3.1b（-）载体上构建带有Flag 标签的SerRS表达质粒，同时构建带有HA 标签的SIRT1、SIRT2重组质 粒，将SIRT1、SIRT2 分别 与SerRS 共转染至HEK293T 细胞中进行过表达。转染48 h 后，收集细胞裂解液，使用Flag M2 磁珠进行免疫共沉淀。Western blot 结果显示，外源Flag-SerRS 和SIRT2-HA 存在明显的相互作用，但没有检测到与SIRT1-HA 的相互作用（图1A）。通过半内源的方法在细胞内过表达lag-SIRT1 与lag-SIRT2，免疫共沉之后检测内源的SerRS，结果与之前相同（图1B）。

有研究报道定位于胞质的TyrRS 在一定条件下可入核与SIRT1 发生结合［18］。我们在293T 细胞中同时过表达外源的SIRT2-HA 和Flag-TyrRS，并没有发现两者的相互作用（图1C）。证明并不是所有细胞质内的SerRS 都能与SIRT2 结合。

SerRS 可增强SIRT2 的去乙酰化酶活性为了验证SerRS 与SIRT2 的相互作用对SIRT2 酶活性的影响，我们使用MAL［Boc-Lys（AC）amc］作为底物来进行去乙酰化酶活性检测。MAL 的N-端与C-端分别与荧光基团和淬灭基团偶联，去乙酰化酶反应前不能发出荧光。一旦SIRT2 进行去乙酰化反应，淬灭基团与MAL 分离，即可发出荧光，去乙酰化酶的活性可通过测量相应的荧光强度来检测。结果发现，SerRS 能显著提升SIRT2 依赖NAD+的去乙酰化酶活性，且随着SerRS 蛋白质浓度的增加，其对SIRT2 酶活的促进作用增强（图2A）。

α-微管蛋白作为SIRT2 去乙酰化底物之一，其乙酰化程度可调控自身的稳定性，进而对糖尿病性心肌病及相关心力衰竭产生一定的影响［19］。我们将微管蛋白作为反应底物，烟酰胺（nicotinamide，NAM）作为SIRT2 去乙酰化反应抑制剂，在体外按照0、1、2 的SerRS 与SIRT2 摩尔浓度比梯度与细胞裂解液在反应液中混合，经Western blot 验证，微管蛋白乙酰化水平随SerRS 浓度增加而不断降低（图2B）。因此，SerRS 可增强SIRT2 酶活性，使α-微管蛋白的乙酰化程度降低。

SIRT2 H187 位点可影响与SerRS 的结合为了寻找影响SIRT2 和SerRS 互作的位点，通过检索文献并对不同物种的SIRT2 之间的同源性进行比对，我们发现SIRT2 上的H187 位点保守性较高（图3A）。该位点对SIRT2 本身依赖NAD+的去乙酰化酶活性有关键作用［20］。当187 位点组氨酸（H）突变成酪氨酸（Y）时，SIRT2 酶活丧失。我们以另一个影响SIRT2 酶活的S368D 突变为对照，通过外源和半内源的方法，检测在细胞内SerRS 和SIRT2 及其H187Y、S368D 突变型是否有相互作用。结果表明：SIRT2 的H187Y 突 变 型 不 再 与SerRS 相 结 合，而S368D 突变却不影响其与SerRS 的相互作用（图3B～3C）。

为进一步确认H187 位点突变对其与SerRS 结合的影响，我们构建了SIRT2 H187A 突变型。当187 位点H 突变成丙氨酸（A）时，会降低SIRT2 的去乙酰化酶活性［20］。我们同样用外源的方法检测了SIRT2 H187A 与SerRS 的相互作用，发现与H187Y 相比，H187A 与SerRS 的 结 合 相对较强，但仍弱于SIRT2 与SerRS 的相互作用（图3D）。结果表明，SIRT2 的H187 位点可调控其与SerRS 的相互作用，当H 突变为Y 时产生的影响最大。

SIRT2 突变位点的结构分析SIRT2 上与SerRS 结合的界面包含两部分，即Gly52-Asp60 和Trp337-Ser356［15］。为了进一步研究SIRT2 H187 位点对其与SerRS 结合的影响，我们尝试从结构生物学的角度进行深入探讨，采用软件对人源SIRT2（PDB ID 编号：1J8F）的H187Y 突变进行了结构模拟（图4）。

与野生型相比，187 位点H 突变为Y 时，会与相邻的Q267 位点发生空间上的冲突。一方面，酪氨酸侧链比组氨酸的更长，所以与267 位谷氨酰胺羰基氧之间的距离从2.5Å 缩短为2.3Å，在空间上不合理；另一方面，突变后187 位点酪氨酸残基侧链变为负电，且与267 位谷氨酰胺的羰基相斥。由此推测，H187Y 突变体破坏了复合结构中同267 位Q 的相互作用，进而影响SIRT2 的构象，使其与SerRS 相互作用的2 个位点发生了距离改变，进而影响其与SerRS 的相互作用。

SerRS 可被SIRT2 去乙酰化因为SIRT2 能够与SerRS 相互作用，且SIRT2 是去乙酰化酶，为探究SerRS 是否存在乙酰化修饰，我们通过NAM 处理细胞进行检测。首先在细胞内进行Flag-SerRS转染，12 h 后用5 mmol/L NAM 按照0、2、4 h 时间梯度处理，随后裂解细胞并使用Flag 磁珠进行免疫共沉淀。Western blot 结果显示，SerRS 存在乙酰化修饰，且随着NAM 处理时间增加，乙酰化水平不断提高（图5A）。因此确定Sirtuins 为SerRS 的去乙酰化修饰酶。

进一步在细胞内共转染Flag-SerRS 与SIRT2-HA，免疫共沉淀后经Western blot 检测显示，SIRT2在细胞内过表达，SerRS 的乙酰化程度下降（图5B）。因此认为，SIRT2 是SerRS 的去乙酰化酶。

讨 论

乙酰化修饰在表观遗传及代谢调控中具有重要的作用，其调控的紊乱与许多疾病密切相关，包括神经系统疾病［21］、癌症［22］和心血管疾病［23］等。心血管疾病作为威胁人类健康的一大疾病，已知的发病机制涉及氧化应激、细胞自噬、细胞的凋亡与再生等，这些都被证明与SIRT2 紧密相关。

心力衰竭是许多心血管疾病常见的终末期病症，其特征之一是心肌的病理性肥大。有研究发现，与野生型小鼠相比，SIRT2 敲除小鼠在注入血管紧张素Ⅱ后，心肌肥厚、纤维化加重，心脏功能受损。相反，SIRT2 过表达可防止损伤［24］。体外实验表明，SIRT2 过表达可保护心肌细胞在血清饥饿条件下不发生凋亡，而NAM 则可抑制SIRT2 进而促进心肌细胞凋亡［25］。但是，SIRT2 在心血管疾病中的确切作用仍需要进一步研究，以验证SIRT2 是否能像SIRT1 或SIRT3 一样，成为心血管疾病治疗或预防的靶点。SIRT2 抑制剂已经在治疗神经退行性疾病中显示出积极的意义，有研究发现抑制SIRT2 可在细胞水平上减少帕金森病相关毒性蛋白α-synuclein 的积累和聚集［26］。

SerRS 定位于细胞质，属于第二类AARS。其结构中特有的UNE-S 结构域中存在核定位信号（nuclear localization signal，NLS），能引导SerRS 入核［27］，进而参与血管生成的调控。在心血管疾病中，血管生成对梗死后心脏和循环功能的恢复至关重要，血管生成不足会阻止缺血后的恢复，并可能导致心肌梗死后的心力衰竭［28］。研究发现，当斑马鱼体内SIRT2 的蛋白质表达量降低时，VEGFA 的表达量上升，血管生成增加［15］。

SerRS 可以通过招募SIRT2 入核，对VEGFA基因的组蛋白去修饰以抑制其表达。SIRT1 和SIRT2 在血管内皮细胞中高表达，且都可介导氧化应激反应，通过药物抑制SIRT2 可以降低氧化应激诱导的内皮细胞毒性［29］。我们通过免疫共沉淀验证了SerRS 能够与SIRT2 相互作用，而不与SIRT1结合。SIRT2 通过调节α-微管蛋白的乙酰化水平，导致血管重构，从而调节血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞迁移［30］。以α-微管蛋白为底物，我们发现SerRS 与SIRT2 的相互作用可增强SIRT2 的去乙酰化酶活性。由于SIRT2 主要定位于细胞质中，参与调控多种生理过程，SerRS 也同样定位于胞质，两者相互作用后在SerRS 的核定位信号引导下入核。从另一角度说明，SerRS 对SIRT2 酶活的增强作用可能对整体代谢水平产生影响，这为研究心血管疾病提供了一个新的思路。

目前对SerRS 如何在细胞核中控制VEGFA 表达已研究得较为清楚，但其中SerRS 的作用及其激活SIRT2 的机制却并不清楚。通过数据比对，我们发现SIRT2 的H187 位点保守性较高，而该位点也是SIRT2 的去乙酰化活性的关键位点。对该位点的深入探究显示，H187A 突变可降低SIRT2 去乙酰化酶活性，同时其与SerRS 的结合减弱。而使SIRT2 失活的H187Y 突变则阻断了SIRT2 与SerRS 的结合。以上结果初步表明，SIRT2 的H187位点对其与SerRS 的结合具有重要的调控作用，尤其是SIRT2 H187Y 突变型不与SerRS 结合。根据上述结果，通过结构模拟发现，187 位点突变为酪氨酸后，会与相邻的Q267 位点发生空间上的冲突，可能改变SIRT2 构象，进而影响SIRT2 与SerRS 的结合。SerRS 在许多恶性肿瘤中高表达，分析其原因，除了其氨基酰化功能在蛋白质合成中至关重要外，也存在SerRS 参与其他信号通路的调控，进而影响肿瘤发生发展的可能性。可以通过调控SIRT2 的H187 位点来影响SerRS 对SIRT2 的招募及激活作用，同时不影响SerRS 本身的氨酰化活性。

由于SIRT2 为去乙酰化酶，我们通过实验发现SerRS 存在 乙 酰 化修 饰，且SIRT2 可 调控SerRS 的乙酰化水平。乙酰化修饰与蛋白质降解、核定位等功能相关，同时SerRS 招募SIRT2 入核会影响血管生成，所以SIRT2 对SerRS 乙酰化修饰的调控很可能在该过程中发挥功能。结合上述发现的H187 位点对SIRT2 自身去乙酰化酶活性有重要影响，后续的工作可进一步研究SIRT2 对SerRS 的乙酰化调控机制及其在疾病和肿瘤发生、发展中的作用。

综上，本研究发现了SerRS 作用于SIRT2 并增强其酶活的潜在位点，拓展了对于SerRS 和SIRT2在许多相关疾病中的认识，并为针对SIRT2 的药物研发以及相关疾病的治疗提供了新的思路。