溶血血小板活化因子乙酰基转移酶（LPAFAT）活性检测方法的比较

胡傢椿 董继斌 楼 滨 李英霞 蒋宪成 丁庭波

（1复旦大学药学院药理与生化教研室，2合成药物化学教研室，3药学实验教学中心 上海 201203）

血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）是一种强效的磷脂类炎症介质，化学结构为1-O-烷基-2-乙酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱。内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多种细胞可合成PAF并释放入血液。PAF 可参与多种生理病理过程，如过敏反应，哮喘和动脉粥样硬化等。PAF 通过结合细胞膜上的PAF 受体（PAF receptor，PAFR）发挥生物学活性，PAFR 是一种G 蛋白偶联受体［1-3］。血浆中的PAF 可被PAF 乙酰基水解酶催化为溶血血小板活化因子（Lyso-PAF），从而失去PAF 的生物学活性［4-5］。细胞内PAF 的生成有两种途径，一种是从头合成途径，该途径合成的PAF 参与维持细胞的正常生理功能；另一种生成PAF 的途径为磷脂重构（即Lands’cycle）：在炎症刺激下，细胞膜的PAF 被iPLA2（细胞内钙离子非依赖性磷脂酶A2）水解，去除Sn-2 位脂酰基，生成Lyso-PAF，然后在Lyso-PAF 乙酰基转移酶（Lyso-PAF acetyl transferase，LPAFAT）催化下，Lyso-PAF 的Sn-2 位羟基乙酰化而生成PAF。LPAFAT 的底物为Lyso-PAF 和乙酰CoA，其产物为PAF 和CoA-SH［5-6］（图1）。

血浆中的PAF 浓度虽然只有pmol/L 级，但造成的炎症效应强大，参与了多种病理过程，抑制PAF 引起的炎症效应是当前的研究热点之一。已有文献以PAFR 为靶标，研究开发PAFR 的拮抗剂，并已有药物应用于临床，而新的PAFR 拮抗剂还在陆续开发［7］。在此类药物开发过程中，Deng等［8］发现了一种不依赖PAFR 的PAF 病理效应，单独拮抗PAFR 并不能达到理想的药理学作用，因此如何减少血浆中炎症性PAF 的浓度成为接下来的重要研究方向。研究表明血浆中的一些多肽或其衍生物可以结合PAF 本身，从而降低PAF 的致炎效应，进而削弱PAF 的药理学作用［9-10］。另一种减少PAF 炎症效应的方法是开发LPAFAT 抑制剂，以减少体内PAF 的生物合成。目前LPAFAT 抑制剂的开发已经取得较大进展，文献报道至少有4 种母核具有LPAFAT 的抑制活性［11-13］。

在开发LPAFAT 抑制剂的过程中，我们采用了多种LPAFAT 活性的检测方法，并用这些方法筛选化合物的抑制活性。本文采用一个阳性抑制剂TSI-01［12］和一个假阳性抑制剂硝酸咪康唑为例，评价常用的LPAFAT 活性测定方法在抑制剂筛选中的优缺点。

材料和方法

实验材料硝酸咪康唑（M3512），化合物TSI-01 由复旦大学药学院合成药物化学教研室合成并鉴定，Lyso-PAF（L5016），乙酰CoA（A2056），还原性CoA-SH（C4780），PAF 标准品（P4904），CPM［7-Diethylamino-3- （4-maleimidophenyl） -4-methylcoumarin］（C1484）（美 国Sigma-Aldrich 公司），NBD-Lyso PC（Avanti Polar lipids，810128P），HPTLC 硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司，型号HSG），其他常规试剂均为国药集团分析纯产品。

LC/MS/MS 检测PAF 含量本文利用天然底物Lyso-PAF 和乙酰CoA 建立酶促反应，在高效液相色谱和二级质谱的分离和检测下，直接测定产物PAF 的含量。方法参考文献［12，14］并略有修改。

肾微粒体的分离 低温超速离心法分离肾微粒 体（LPAFAT 来 源）为 常 规 方 法［10］。冰浴下C57BL/6小鼠肾脏在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、300 mmol/L 蔗糖缓冲液中充分匀浆，匀浆液于4 ℃9 000×g离心10 min，取上清在4 ℃100 000×g离 心1 h，沉 淀 用100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2、0.007 5% Tween-20 缓冲液悬浮，-80 ℃保存备用。

体外酶促反应的建立 含100 μg 蛋白的肾微粒 体 悬 浮 于100 μL 含100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20 缓冲液中，在冰浴中加入浓度为0.5 mg/mL 的Lyso-PAF 6 μL（溶剂为1∶1 的二甲亚砜∶甲醇，v/v）和浓度为2 mg/mL 的乙酰CoA 水溶液6 μL。加入溶解于二甲亚砜的TSI-01（储备液浓度10 mmol/L）/硝酸咪康唑（储备液浓度10 mmol/L）或加入等量二甲亚砜作为对照，使TSI-01 或硝酸咪康唑在反应体系中的终浓度分别为0、10、30、100 μmol/L，上述体系混匀后放置于37 ℃水浴10 min。

脂类的提取 在上述反应体系中加入300 μL的氯仿∶甲醇（2∶1，v/v）萃取溶剂。剧烈震荡30 s 后9 000×g离心10 min。各组吸取等量下层有机相转移入新的试管，用氮吹仪将有机相吹干。样品保存于-80 ℃备用。PAF 标准品用氯仿溶解，配制成不同浓度，各取50 μL 用氮吹仪吹干待用。

LC/MS/MS 检测 样品或不同含量的PAF 标准品用50 μL 的异丙醇∶乙腈（1∶1，v/v）复溶进样。分析采用HPLC Eksigent LC100 偶联AB SCIEX Triple TOF 5600+质谱。HPLC 色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18，3.5 μm，2.1×100 mmol/L，预 柱：Phenomenex C18，4×20 mmol/L，柱 温：50 ℃，进样室温度：4 ℃，流速：0.4 mL/min，进样体积：2 μL，流动相A：10 mmol/L 乙酸铵+0.1%甲酸+99.9% 水，流 动 相B：10 mmol/L 乙 酸 铵+0.1% 甲酸+49.95%乙腈+49.95%异丙醇，流动相A 和B 的比例随时间梯度变化。质谱采用负离子模式。

数据处理 参照PAF 标准品数据，用PeakView 1.2软件将样品中的PAF 定性，用MultiQuant 2.1 对定性的PAF 定量。

巯基反应探针偶联分光光度法检测产物CoA-SH 含量分析法利用天然底物Lyso PAF 和乙酰CoA 建立酶促反应，用巯基反应探针CPM 与产物CoA-SH 的巯基反应产生荧光信号，通过荧光信号的强弱判断酶活性大小。本方法在文献［12］基础上略有改进。

体外酶促反应的建立 参考“LC/MS/MS 检测PAF 含量法”中的第二步。

产物信号检测 在反应体系中加入100 μL 甲醇，剧 烈 震 荡30 s 后9 000×g离 心10 min。将50 μL 上清转移入96 孔荧光酶标板，每孔样品中加入50 μL 含5 μmol/L CPM（CPM 溶解于甲醇配制成0.5 mg/mL 母液，约为1.242 mmol/L）的50%甲醇水溶液。震摇96 孔板混匀，室温静置2 h 后用BioTek Flx800酶标仪检测荧光信号，激发光350 nm，发射光450 nm，数据采用底读方式，灵敏度设置为50。

化合物与CoA-SH 反应的检测 96 孔荧光酶标板各孔中加入50 μL 含有还原性CoA-SH（终浓度为20 μg/mL）的缓冲溶液A，然后加入各种不同浓度的硝酸咪康唑或化合物TSI-01，混匀后室温孵育30 min，随 后 各 孔 加 入50 μL 含5 μmol/L CPM 的50%甲醇水溶液。后续操作和数据检测参考“产物信号检测”。

TLC 检测荧光标记产物分析法以荧光标记的Lyso-PAF（或Lyso-PC，图1A）和乙酰CoA 作为底物建立酶促反应，产物为荧光标记的PAF 或类似物，通过产物的荧光信号强弱判断酶活性大小。方法参考文献［15-16］略有修改。

体外酶促反应的建立 含100 μg 蛋白的肾微粒体悬浮于100 μL 100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20 缓 冲 液 中，在冰浴中加入浓度为0.5 mg/mL 的NBD-Lyso PC 4 μL 和浓 度 为2 mg/mL 的 乙 酰CoA 水溶 液6 μL。加入溶解于二甲亚砜的TSI-01（储备液浓度10 mmol/L）或硝酸咪康唑（储备液浓度10 mmol/L）或加入等量二甲亚砜作为对照，使TSI-01 或硝酸咪康唑在反应体系中的终浓度分别为0、10、30、100 μmol/L。上述体系混匀后放置于37 ℃水浴10 min。

脂类的提取 参考“LC/MS/MS 检测PAF 含量”中的第三步。

薄层层析（TLC）分离分析 上述脂类提取物用40 μL 氯仿复溶，用毛细玻璃管将样品装载于HPTLC 硅胶板，采用氯仿∶甲醇∶水（65∶25∶4，v/v）展开10 min。待有机溶剂挥发干净，在紫外灯下激发荧光并拍照。条带光密度采用Smart View 软件分析。

数据统计及作图 每组至少3 次实验，数据表示为x±s，两组之间的比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。所有数据用GraphPad Prism 6.0 软件作图。化合物分子结构采用ChemBioDraw Ultra 14.0 软件绘制。

结 果

LC/MS/MS 检 测PAF 含 量 法LC/MS/MS 的响应值（峰面积）对应PAF 含量（pmol/L）的关系见图2A，PAF 在0～50 pmol/L 范围内，LC/MS/MS的响应值呈现良好的线性关系（回归系数r＞0.99）。1 pmol/L 范围以内的PAF 与LC/MS/MS 响应值之间的标准曲线如图2B。根据本文建立的酶促反应，用LC/MS/MS 检测所获得的PAF 峰面积均在100 000 自由单位以内，根据标准曲线计算所得PAF 产物均在2 pmol/L 以内。我们通过增减底物种类及使用不同浓度的抑制剂建立酶促反应，产物PAF 的含量随各种因素变化的关系见图2C。结果表明，TSI-01 对LPAFAT 活性有抑制作用，在100 μmol/L 浓度范围内，其抑制作用呈剂量依赖性。硝酸咪康唑没有LPAFAT 抑制活性。

巯基反应探针偶联分光光度法检测产物CoASH 含量分析法CPM 本身几乎没有荧光信号，但CPM 与还原性巯基反应后生成的荧光信号很强烈。本研究中，CPM 与还原性巯基的反应发生在荧光酶标板中，2 h 内室温下产生的荧光信号强弱随时间的延长而加强。因孵育时间的长短对检测信号的强弱影响很大，所以不同批次实验得到的数据没有可比性。在同一批次下，CPM 本身、肾微粒体、酶促反应底物Lyso-PAF 与乙酰辅酶A 对荧光信号的影响见图3A。该结果表明，仅有肾微粒体及仅有CPM条件下几乎没有荧光信号（图3A 柱1 和柱2）。不加入底物Lyso-PAF 和乙酰辅酶A 的条件下，本方法即产生较强的噪音信号（由肾微粒体和CPM 两种因素同时存在时产生的荧光信号），噪音信号占总信号比例约为39%（图3A 柱3）。单独加入底物Lyso-PAF并不增强荧光信号（图3A 柱4），但单独加入底物乙酰辅酶A，荧光信号即达到峰值（图3A 柱5），即使加入两种底物也并未继续增加荧光信号（图3A 柱6）。这种结果表明，在不加入Lyso-PAF 的条件下，即使单独加入底物乙酰辅酶A，酶促反应中已发生大量的乙酰基转移反应而产生了还原性CoA-SH。蛋白质在酶催化或无酶催化下均可发生乙酰化反应。我们用牛血清白蛋白作为乙酰化受体证实了这一现象（图3B）。由于本方法中蛋白的乙酰化反应即已生成大量的还原性CoA-SH（图3A 柱5），真正由LPAFAT 催化后生成的还原性CoA-SH 与CPM 反应产生的荧光信号极微弱（图3A 柱6 与柱5 的差值），因而本方法并不能准确判断LPAFAT 活性的大小。但是，我们用本方法检测TSI-01 和硝酸咪康唑对LPAFAT 的抑制作用时，却得到如图3C 所示的实验结果。该结果表明TSI-01 呈剂量依赖性地减少由CPM 与还原性CoA-SH 反应产生的荧光信号。经过对TSI-01 结构的分析，我们猜测该化合物可直接与还原性CoA-SH 发生迈克尔加成反应，从而消耗大量还原性CoA-SH，减少了还原性CoA-SH 与CPM 反应生成的荧光信号。为验证这一假设，我们用还原性CoA-SH 标准品与TSI-01 反应，然后用CPM 检测剩余还原性CoA-SH 的含量（图3D），该结果表明TSI-01 呈剂量依赖性地减少由CPM 与还原性CoA-SH 反应产生的荧光信号。

TLC 检测荧光标记产物分析法NBD-Lyso PC 中，荧光基团与Sn-1 位的脂酰基连接，由于细胞匀浆或微粒体中存在的磷脂酶A1 活性很强，在酶促反应中生成了大量副产物NBD 标记的游离脂肪酸（图4 中NBD-FFA 条带）。尽管如此，以NBDLyso PC 和乙酰CoA 为底物，仍然可以测定LPAFAT 的活性（图4 中NBD-PAF 类似物条带）。不同浓度的TSI-01 和硝酸咪康唑对LPAFAT 都有抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性（图4A、4B）。

讨 论

动物血浆或细胞中生理条件下的PAF 含量极其微少，至今已发展出多种方法监测生理条件下的PAF 含量。有学者将PAF 衍生加入荧光基团后，用高效液相色谱检测，可检测低至100 pg 的PAF。但该方法费时，样品容易损失而引入操作误差［17］。至今最灵敏的方法是先去除PAF 的磷酸胆碱极性基团，替代为非极性基团，成为挥发性物质，然后用气相色谱和质谱联用检测，可检测到低至50 fg 的PAF［14］。但该方法同样费时，样品容易损失而引入操作误差，价格也很高昂。用高效液相色谱和二级质谱联用直接对PAF 检测，文献报道称可检测到低至1 pg（1.9 fmol）的PAF［14］。本 文 所 建 立 的LC/MS/MS 方法可检测到低至0.01 pmol 的PAF，足以用于体外监测LPAFAT 的活性。该方法省时，由人为操作引入的误差小，数据重现性高，但检测成本依然较高。通过LC/MS/MS 方法检测PAF 的含量来判断LPAFAT 活性，与本文介绍的其他两种方法比较，优点在于建立酶促反应时，所使用的底物均是天然结构，最符合酶与天然底物的结合状态，能准确判断LPAFAT 的真实活性及化合物对该酶是否具有真实的抑制作用。本文采用两种化合物TSI-01 和硝酸咪康唑，TSI-01 对LPAFAT 具有抑制作用，但硝酸咪康唑并没有LPAFAT 的抑制活性（图2C）。

LPAFAT 催化反应的产物除了PAF，还有CoA-SH。通过检测CoA-SH 的含量来判断酶活性大小，具备良好潜力。在本文建立的酶促反应中，底物乙酰CoA 发生了非特异性的转乙酰基反应，因而产生了大量的CoA-SH，造成该方法的本底噪音较大（图3A 柱5 与柱4 的差值）。这种大量的转乙酰基反应可能由蛋白的乙酰化造成（图3B）。巯基反应探针CPM 除了与CoA-SH 反应产生荧光外，其与蛋白质中的还原性-SH 基团反应也可产生荧光信号（该数据在本文没有提供）。与Tarui 等［12］采用的方法相比，本文已有改进，我们在酶促反应结束后用甲醇将大量蛋白沉淀，使其与CoA-SH 分离，但上清中仍然残留少量蛋白质（带有还原性-SH 基团），也是本底噪音信号的来源之一（图3A 柱3 和柱4，图3B 柱1）。除了底物乙酰CoA 外，加入另一个底物Lyso PAF，并没有使由LPAFAT 催化产生的CoASH 信号大幅提升（图3A 柱6 与柱5 的差值），所以该方法并不适合于检测LPAFAT 的催化活性。

与巯基反应探针CPM 的官能团一样，TSI-01的母核也是马来酰亚胺，与蛋白质中的还原性-SH或CoA-SH 中的-SH 都可以发生迈克尔加成反应。当TSI-01 在酶促反应中存在时，已与蛋白质中的-SH 和生成的CoA-SH 中的-SH 发生了反应，消耗了大量-SH 基团，因而在最终加入CPM 检测CoA-SH含量时，荧光信号对TSI-01 的浓度有剂量依赖性的变化（图3C）。虽然TSI-01 确实具有LPAFAT 抑制作用（图2C），但图3C 中荧光信号的减弱却并非由于该化合物的LPAFAT 抑制活性所引起。Tarui等［12］在筛选LPCAT2 抑制剂时，从 化 合 物 库中的174 131 个化合物库中筛选的第一步，使用的正是这种方法。他们在后续筛选中采用了LC/MS/MS 方法，但正是由于第一步筛选方法的失误，造成最终筛选出来的十数个化合物虽然具有LPAFAT 活性，其IC50可低至0.13 μmol/L，但这些化合物的母核均是马来酰亚胺。这批化合物除了与CoA-SH 反应外，均可非特异性的与蛋白质中的-SH 反应，因而不具有成药性。

荧光信号具有灵敏度高，易于显影和定量的特点，因而荧光基团标记底物用于检测酶活性或筛选酶 的 抑 制剂也逐步被 广 泛 采 用［15-16，18-19］。但荧光基团标记底物后改变了底物的天然结构，可能造成酶与底物的结合并不符合天然状态。由于市面上没有荧光标记的Lyso PAF 销售，我们采用易于购买的NBD 标记的Lyso PC。Lyso PC 与Lyso PAF 的结构非常相似，两者的差别仅在于甘油骨架的Sn-1位所连接基团的化学键，Lyso PAF 的Sn-1 位为醚键而Lyso PC 的Sn-1 位为酯键（图1A）。以NBDLyso PC 和乙酰CoA 为 底 物，可以测定LPAFAT 的活性（图4）。采用这种方法可见TSI-01 对LPAFAT具有抑制作用（图4A），但并无LPAFAT 抑制活性的硝酸咪康唑也可以抑制产物NBD-PAF 类似物的生成，且呈剂量依赖性（图4B）。用荧光标记底物建立酶促反应，检测荧光标记产物的分析方法，有可能对酶的催化活性或抑制剂的筛选造成误判。硝酸咪康唑即是一种假阳性抑制剂。

由于蛋白质的乙酰化反应可产生大量的CoASH，干扰了对LPAFAT 活性的正确判断，因此通过产物CoA-SH 的含量测定LPAFAT 活性的方法虽然具备良好潜力，但也存在严重缺陷，仍需进一步优化。

用荧光标记底物建立酶促反应，通过产物NBD-PAF（类似物）的荧光强度可用于LPAFAT活性检测及抑制剂的筛选。该方法对酶的催化活性或抑制剂的筛选可能有误判，因此应慎重对待实验结果。由于成本低，易于操作，在化合物的早期初筛时可采用此办法。

用天然结构的底物Lyso-PAF 和乙酰CoA 建立酶促反应，通过LC/MS/MS 测定产物PAF 的含量，是判断LPAFAT 活性或筛选其抑制剂的最佳方法，可作为最终判定的依据，但价格昂贵。