小豆种质资源总黄酮含量测定及其与农艺性状相关分析

刘靖崧 谢继芳 杨 凯 赵 波 李奕松 万 平

(农业应用新技术北京市重点实验室；北京农学院植物科学技术学院1，北京 102206)(农业农村部华北都市农业重点实验室；北京农学院生物与资源环境学院2，北京 102206)

小豆(VignaangularisL.)，起源于中国，属豆科(Leguminosae)、 菜豆族(Phaseoleae)、 豇豆属(Vigna)，在我国已有12 000年栽培历史[1]，是重要的食用豆之一，在世界上30多个国家种植。Yamaguchi等[2]根据生态学、形态学等主要特征，将小豆分为栽培种、野生种和半野生种。中国具有丰富的小豆种质资源并且表现出较高的遗传多样性[3]。小豆籽粒含小豆皂苷、三萜、类黄酮和多酚等生物活性物质，具有祛湿、消肿、解毒、降血糖血脂、减肥、降低胆固醇等保健功能和药用价值[4]。类黄酮对人体健康有多种益处，有抗氧化[5]、抗菌[6]、抗癌[7]等作用，黄酮类化合物的研究是国内外研究的热点之一。

迄今，小豆中有关来源广泛的种质资源材料类黄酮含量测定和野生小豆类黄酮含量分析鲜见报道。本研究采用紫外分光光度法测定279份小豆籽粒中黄酮类化合物含量，比较了栽培小豆及其祖先种野生小豆种质资源总类黄酮含量的差异，分析了总类黄酮含量与籽粒性状、Lab值之间的相关性，旨在建立和完善小豆类黄酮含量测定体系，筛选优异种质资源，挖掘优异基因，为小豆高类黄酮含量生物强化育种和GWAS分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料由北京农学院食用豆研究团队提供，共279份来源广泛的野生、半野生和栽培小豆种质资源自然群体，包括中外栽培小豆213份(160份地方品种和53份育成品种)、中外野生小豆35份、中外半野生小豆31份(表1)。材料种植于北京农学院实验基地，成熟后收获种子。

表1 供试材料列表

1.2 方法

1.2.1 总黄酮的提取及测定

将小豆种子放入FW100高速万能粉碎机中粉碎磨细，过100目筛，后在42 ℃干燥箱中干燥过夜，取粉末约0.2 g，3次重复，精密称定于2 mL离心管中，加入1 mL 80%甲醇(分析纯)，涡旋处理10 min让样品与溶剂充分混合，40 Hz条件下超声提取90 min，后12 000 r/min离心20 min，倒出上清待用。

取提取液上清100 μL，加入ddH2O 800 μL，5% NaNO260 μL，混合均匀，5 min后，加入10%AlCl360 μL混匀，静置，10 min后，加入400 μL 1 mol/L NaOH，再加入ddH2O补至2 mL，分光法测定510 nm处吸光值。空白对照为水，其他操作相同。使用芦丁作为总黄酮的标准品配制成不同浓度，按操作步骤制作标准曲线，根据读数在标准曲线中测定总黄酮浓度，总黄酮含量用mg芦丁当量RE/g表示。测定仪器为UV-2100型紫外可见分光光度计。

设置14个梯度10～75 μg/mL，精密量取芦丁标准品配成溶液用于标准曲线测定。以吸光度A为纵坐标，浓度C(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.011 2x-0.002 2，R2=0.997 5，芦丁在10～75 μg /mL浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。

1.2.2 农艺性状调查及测定

田间性状调查和室内性状考种按照《小豆种质资源描述规范和数据标准》[23]和《The AsianVigna: genusVignasubgenusceratotropisgenetic resources.》[24]标准进行。田间调查包括：现花期、盛花期、第一荚成熟和100%成熟。挂牌单株进行室内考种，收获的种子用SC-G型自动考种分析及千粒重仪，正片扫描自动导出种子性状相关参数，包括百粒重、面积和单株产量。具体调查性状及调查标准见表2。

表2 农艺性状调查标准

使用cR400b色彩色差计进行测定[25]。用1976年cIE制定的Lab表色系的方法测定小豆粒色的Lab值，Lab分别代表着亮度值、红度值和黄度值。测定过程中，在每个单株中随机抽取25粒左右较好的籽粒，擦净并且使所有籽粒的种脐背对测量仪器进行测定。每份材料取3株进行测定，每株测定3次。

1.2.3 数据分析

使用IBM SPSS Statistics17分析数据，基于Pearson相关性(双尾)的双变量相关性确定不同性状之间相关性的显著性。

2 结果与讨论

2.1 小豆总黄酮含量分析

不同小豆种质资源间总黄酮含量差异明显，栽培小豆中育成和地方品种的总黄酮含量均值分别为2.95 mg RE/g和3.31 mg RE/g，半野生和野生小豆分别为3.55 mg RE/g和4.06 mg RE/g(表3)。野生小豆总黄酮含量显著高于半野生小豆、地方品种和育成品种，半野生小豆和地方品种总黄酮含量显著高于育成品种，半野生小豆和地方品种间总黄酮含量差异未达显著水平。不同小豆变异系数存在差异，且与材料份数有关，依次是地方品种、育成品种、野生小豆和半野生小豆，地方品种多样性高。野生小豆总黄酮含量普遍偏高，含量高于3.56 mg RE/g的材料约占75%；半野生小豆高于3.52 mg RE/g的材料约占55%；地方小豆高于3.56 mg RE/g的材料约占37%；育成小豆总黄酮含量偏低，含量高于3.57 mg RE/g的材料仅占19%，约60%材料的总黄酮含量集中分布在2.30～3.50 mg RE/g之间。在小豆驯化选择进程中，总黄酮含量降低。

表3 不同类型小豆总黄酮含量

大豆类黄酮主要是异黄酮，来永才等[26]分析黑龙江省247份野生和栽培大豆异黄酮含量，明确了野生大豆异黄酮平均含量高于栽培大豆。林红等[27]测定60份野生和栽培大豆的含量异黄酮含量，野生大豆平均含量3.020 mg/g，育成品种平均2.686 mg/g。周三等[28]研究表明，野生大豆的异黄酮的总含量大于普通栽培大豆，与本研究结果相同。王春娥等[22]测定野生大豆、地方品种与育成品种大豆异黄酮总含量分别为2.995、3.241、2.705 mg/g，地方品种平均值与变幅均大于野生大豆，育成品种平均值与变幅则低于野生大豆，显然小豆的总黄酮含量较高。栽培小豆总黄酮含量普遍低于野生小豆，可能是由于黄酮类物质引起豆制品苦涩味和影响品质29]，而由人工选择降低。

不同研究中用儿茶素为标样测定小豆总黄酮平均含量分别为2.75 mg CE/g[30]、5.81 mg CE/g[31]；Woo等[32]测定7个韩国小豆品种的总黄酮为2.61～28.95 mg CE/g，变异幅度大；Lee等[22]用槲皮素作标样测定小豆的总黄酮含量0.17～0.91 mg QE/g。本研究以芦丁为标样测定279份野生和栽培小豆种质的总黄酮含量平均值为3.47 mg RE/g(1.12～5.97 mg RE/g)，可见小豆中芦丁、儿茶素含量高于槲皮素。Liu等[21]研究表明小豆主要有儿茶素、牡荆素-4”-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香苷。Wang等[14]研究显示大豆、豇豆、绿豆和小扁豆中儿茶素含量分别为0.892、0.441、0.111、0.08 mg/g。Gan等[15]测定大豆、豇豆和绿豆中儿茶素含量分别是0.785、3.34、0.971 mg CE/g，比较而言小豆的儿茶素含量较高。

初步分析不同中国地理来源栽培小豆种质资源总黄酮平均含量，甘肃、贵州和宁夏资源总黄酮含量最高，超过4.00 mg CE/g；云南、湖北、陕西、湖南资源其次。北方地区来源材料普遍低于南方地区，但吉林省来源材料除外，推测有些来自吉林可能有的系由南方引进或有南方地区及日本的血统。北京市、天津市、山东省较低，河北省和黑龙江省最低；广东省和浙江省来源的材料总黄酮含量最低，可能是由于海拔低。黄酮含量总体趋势是由西南地区向东北地区降低，随着经纬度升高而降低的趋势(表4)。除此之外，结合中国地形图分析发现，中国栽培小豆总黄酮含量分布图与其重合度较高，即中国栽培小豆总黄酮含量随着海拔降低而降低，进一步分析需要测定多年多点种质资源的黄酮含量。有研究表明海拔升高可以增加类黄酮含量和抗氧化能力，因为在较高海拔处的太阳辐射的增加导致正二羟基化类黄酮的生物合成增加，本结果与Yao等[33]研究一致。

表4 不同地域栽培小豆总黄酮含量情况

2.2 总黄酮含量与农艺性状的相关性分析

小豆总黄酮平均含量与农艺性状相关性分析显示总黄酮含量与现花期、盛花期、第一荚成熟、100%成熟呈极显著正相关，与籽粒亮度值L呈显著正相关，与百粒重、种子面积、红度值a、经度呈极显著负相关，与纬度呈显著负相关，与单株产量和黄度值b未达显著水平，与面积相关性最大(R=-0.404，P<0.01)(表5)。种子小的小豆种皮与籽粒的比表面积相对较大，而黄酮类物质主要存在于豆类物质的种皮中[36]，故种子小的小豆种质资源总黄酮含量较高，相对营养好于大粒。野生小豆生长在自然环境条件下，多在生态条件破坏少的山区存留，繁殖系数高，百粒重小于3 g；种子小合成相对较多的黄酮类次生代谢物利于克服逆境[37]。Lab色彩模式是一种颜色标定模式，L代表亮度值，范围在0～100，最暗为0，最亮为100，a是由绿到红的色彩变化值，范围在-128～+128，纯绿为-128，纯红为+128，b是由蓝到黄的色彩变化值，范围在-128～+128，纯蓝为-128，纯黄为+128 ；L、a、b值分别代表了小豆的粒色情况，小豆种子总黄酮的含量与种皮的颜色相关，暗色籽粒小豆总黄酮含量低于亮色，红色种皮小豆总黄酮含量低于绿色。

表5 小豆总黄酮含量与农艺性状的相关系数

3 结论

通过对279份来源广泛的中外野生、半野生和栽培小豆种质资源自然群体的总黄酮含量的测定，野生小豆和栽培小豆间差异明显。小豆种质资源总黄酮含量变异广泛，变幅为1.12～5.97 mg RE/g，变异系数为21.66%；总黄酮含量为野生小豆>半野生小豆>地方品种>育成品种。小豆总黄酮含量与现花期、盛花期、第一荚成熟、100%成熟呈极显著正相关，与籽粒亮度值L呈显著正相关，与百粒重、面积、红度值a、地理经度呈极显著负相关，与地理纬度呈显著负相关。与面积相关性最大(R=-0.404，P<0.01)。小豆籽粒总黄酮的含量和种皮的颜色相关，亮度值低的籽粒总黄酮含量低于亮度值高的，红色种皮小豆总黄酮含量低于绿色。不同地理来源的小豆，总黄酮含量随着经纬度升高而降低，随着海拔降低而降低。