辽宁地区大米中亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(Ⅴ)含量的风险评估

韩晓鸥 平小红 依 萍 李延升

(辽宁省疾病预防控制中心，沈阳 110005)

砷(As)是一种自然存在于地壳、广布于陆地、空气和水中的类金属元素[1-3]，可以分为有机砷和无机砷两种类型。不同种类的砷毒性不同，有机砷化合物如砷胆碱(AsC)和砷甜菜碱(AsB)的毒性可以认为是无毒的，无机砷化合物具有一定毒性，其中五价砷化合物比三价砷化合物的毒性低。砷及无机砷被国际癌症研究机构(LARC)认定为“对人类致癌物质”(Ⅰ类)，而有机砷如DMA、MMA被认定为“可能对人类致癌的物质”(ⅡB类)，AsB等非在人类体内代谢的有机砷化合物被认定为“部分类为对人类有致癌作用”(Ⅲ类)。

短期接触高浓度无机砷会导致腹泻、呕吐、腹痛、剧痛、麻痹、肌肉抽搐甚至死亡，而长期接触无机砷临床上表现为心肌损伤，而进入机体的无机砷会分布在肝组织，后被甲基化代谢，而肾脏也会是砷的蓄积部位和毒性作用的主要器官，因为砷的过量摄入会导致心血管疾病、皮肤色素沉着过度、神经中毒、肺部疾病甚至癌症，如皮肤癌、肺癌、膀胱癌[4,5],且长期接触即使极少量地接触无机砷(2～100 μg/L)也会导致糖尿病、高尿酸血症、痛风等[6-8]。此外，O,Bryant等[9-11]认为长期少量地接触对老年人和成年人的认知能力有潜在的影响，甚至可能会导致阿兹海默症。

食物链中无机砷既可能来源于纯天然，也可能来源于杀虫剂、工业污染、环境污染等人类活动。研究表明稻米也是人类摄入无机砷的主要来源，大米是北方主要的粮食来源，对于稻米中无机砷污染的管理，国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission)食品污染委员会于2014年一致同意采纳将白米中无机砷的限量定位0.20 mg/kg[9],2015年同意采纳将糙米中无机砷的限量定位0.35 mg/kg[10], 2015年欧盟委员会[11]重新修订白米、蒸谷米、糙米、米制饼干及蛋糕等米制食品、婴儿米制食品中的无机砷最大允许浓度，其限量分别为0.020、0.25、0.25、0.30、0.10 mg/kg、随后，2016年美国食品药品管理局(FDA)[12]提议将婴儿米制食品中无机砷的限值设为0.10 mg/kg。而中国的国家标准自2012年以来，对稻谷(稻米)、糙米、大米、婴幼儿谷类辅助食品中无机砷的限量始终均为0.20 mg/kg[13,14]。

虽然无机砷不是禁添加的有害物，但大米是辽宁地区人们的主要主食，几乎每家都以米饭为主食，但目前几乎没有关于辽宁地区大米中无机砷的风险评估报告，为了解辽宁地区大米的风险状况，本研究建立了辽宁地区大米流通领域的暴露评估模型，为相关部门和企业生产风险管理提供参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和设备

UltiMate3000高效液相色谱仪；NexION 300X ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)；KQ5200DB超声波清洗器；Milli-Q超纯水系统；Sorvall ST 16R台式冷冻离心机；LAB DANCER S25漩涡混匀器。

1.2 材料与试剂

无水乙酸钠、磷酸二氢钠、硝酸钾、乙二胺四乙酸钠、硝酸，氨水、正己烷、无水乙醇 As(Ⅲ)(GBW08667)、亚砷酸盐As(Ⅴ)(GBW08666)。

1.3 方法

样品检测

1.3.1 样品前处理

样品混合均匀用粉碎机粉碎，称取样品1.0 g(准确至0.001 g)，置50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 0.15 mol/L的HNO3溶液，放置过夜。置90 ℃恒温箱中热浸提2.5 h，每0.5 h振摇1 min。提取完毕，取出冷却至室温，8 000 r/min离心15 min，取上层清液，经0.45 μm有机滤膜过滤进样测定。

1.3.2 标准配制

亚砷酸盐As(Ⅲ):以亚砷酸根计为124.3 μg/g。用移液枪准确吸取20 μL标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1 000 ng/mL标准溶液使用液。

砷酸盐As(Ⅴ)：以砷酸根计为32.4 μg/g用移液枪准确吸取86 μL标准液，用高纯水定容至1.5 mL，浓度为1 000 ng/mL标准溶液使用液。

分别吸取亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷标准溶液使用液(1 000 ng/ml)10、20、40、加入流动相配制成2.0 mL标准使用液，吸取1 ml，5 μg/L的标准品，用移液枪吸取1 mL纯水配成2.5 μg/L的标准品，吸取100 μL 10 μg/L的标准品，用移液枪吸取900 μL纯水配成1 μg/L的标准品使用液，配制成1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准系列，取100 μL进样。以峰面积(Y)为纵坐标，目标物的质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 色谱条件1.3.3.1 色谱柱

阴离子交换色谱柱，Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)

1.3.3.2 仪器条件

液相条件：流动相：称取 0.895 4 g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，3.026 g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶解于500 mL高纯蒸馏水中，浓度5 mmol/L磷酸氢二钠，45 mmol/L磷酸二氢钾，pH为5.92。ICP-MS:条件RF入射功率：1 550 W；载气为高纯氩气；载气流速0.65 L/min；补偿气0.15 L/min。泵速0.3 r/s；检测质量数m/z=75 (As),m/z=35 (Cl)。

1.3.4 计算公式

HPLC进样分析后，以标准曲线溶液的峰面积为Y值，浓度为X(ng/mL)值，进行标准曲线拟合，得出各物质标准曲线Y=AX+B；样品的测定结果按下式计算：

式中：X为样品中无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的含量(以As计)/mg/kg;C为经标准曲线得到测定溶液中 [A(Ⅲ)或As(Ⅴ)]浓度/μg/L；C0为空白溶液中无机砷化合物[As(Ⅲ)或As(Ⅴ)]的浓度/μg/L；V为消化液体积/mL；m：为样品称样量/g。

1.3.5 风险评估

通过资料表明，大米中确实有无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的检出，本文根据辽宁地区大米中无机砷的检出情况，消防者习惯调查，评估消费者接触大米中无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的概率。

调查是按照辽宁的地理分布进行分层，选择辽宁地区几个典型城市进行抽样检测，其中包括山城，内陆城市，沿海城市，沿江城市，抽取不同区域人流密集的大型商场中的超市，以及老百姓喜欢逛的农贸市场及早市作为调查地点，按时间、地点、包装不同采集样品，测定样品中无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]含量，建立辽宁地区大米中无机砷的危害定量暴露评估模型。建模方法采用概率评估法，即用概率分布来描述模型中的参数或结果，以表示该参数的不确定性和变异性。模型采用Monte Carlo模拟技术，运用风险分析软件@RISK7.5运行与分析。各种概率分布都是采用@RISK7.5提供的标准分布函数来表示，以@RISK软件的语法书写，其形式为：分布名称(参数1，参数2，……)。例如三角形分布有三个参数：最小值、最大值、最可能值，其表达方式为“RiskTriang (最小值，最可能值，最大值)”[15]。

1.3.6 样品采集和测定

辽宁地区大米主要产地为黑龙江省、吉林省、辽宁省的广大平原地区，以及少量进口大米，其中包括五常大米、珍珠米、黑龙江特产江水大米、稻花香米等，在大型超市中以黑龙江省大米，吉林省大米，以及少量进口大米为主，小型农贸及超市以辽宁省本地大米为主，大型超市中大米种类在50种左右，每个城市中选择30份，小型农贸市场及早市中大米种类为20种左右，每个城市采集20份，因此分别从山城，内陆城市，沿海城市，沿江城市，四个城市中采集样品50份，共采集样品200份，使用粉碎机粉碎成大米粉，常温保存，48 h内，对样品中亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)两种无机砷进行检测。结果见表1。

表1 样品检测结果

1.3.7 建立危害定量暴露评估模型

利用@RISK软件，根据以上数据提供的全部信息，计算各种可能的结果，模拟亚砷酸盐在辽宁地区检出的流行率，模拟为RiskTriang(0.02，0.04，0.07)，模拟砷酸盐在辽宁地区检出的流行率，模拟为RiskTriang (0.02，0.04，0.05)由此呈现风险的整个状况。模型的一次模拟进行100次运算，每一次运算时采用Monte Carlo抽样方法，从模型各变量的概率分布中抽取1个值， 对这些随机抽取的数字进行计算。评估的结果以概率分布的形式描述[15]。

2 结果与分析

2.1 方法优化——提取条件的选择

由于实验色谱柱选择的为阴离子色谱柱，且用ICP-MS作为检测器，因此在提取液选择上我们一般用酸性物质，本次实验提取液选择为0.15 mol/L HNO3。在阴性样品中添加1 000 μg/L标准储备液0.1 mL,通过不同情况下回收率的测定，优化检验方法，前处理方法依照1.3.1，重复6次，取平均值，相对标准偏差。

2.1.1 提取溶液体积的选择

在样品量不变的条件下考察不同溶剂体积(5、10、20、30、40 mL)对同一加标样品中亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷提取效果的影响，试样结果见图1。

图1 提取溶剂体积对回收率的影响

从图1中可见，提取溶剂体积为20、30、40 mL 亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷回收率较高，且无显著差异。考虑到增加提取试剂用量会降低方法的灵敏度，且大量酸溶剂的使用不利于环境保护，还会增加检测成本，故选取提取溶液体积为20 mL。

2.1.2 提取温度

在样品中添加相同浓度的标准样品储备液，至恒温箱中热浸提，提取温度分别为(70、80、90、105 ℃)测定回收率，观察温度对亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷回收率的影响。 结果见图2。

图2 提取温度对回收率的影响

由图2中可见，回收率开始增加趋势明显，90 ℃时回收率最高，105 ℃时回收率有所下降因此提取温度设定为90 ℃。

2.1.3 提取时间

在样品中添加同样浓度的标准溶液储备液，制成相同浓度的阳性样品，提取时间分别定为1、2、2.5、3、4 h，检测不同提取时间对亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷回收率的影响。结果见图3。

图3 提取时间回收率的影响

图3表明，随着提取时间的增加，As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)回收率开始增加趋势明显后基本保持不变，因此选择2.5 h为提取时间。

2.2 线性范围和检出限

按照1.3.1方法配制标准储备液，分别吸取亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷标准溶液使用液(1 000 ng/ml)10、20、40、加入流动相配制成2.0 mL标准使用液，吸取1 mL，5 μg/L的标准品，用移液枪吸取1 mL纯水配成2.5 μg/L的标准品，吸取100 μL 10 μg/L的标准品，用移液枪吸取900 μL纯水配成1 μg/L的标准品使用液，配制成1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL,取100 μL进样。以峰面积(Y)为纵坐标，目标物的质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，线性方程及相关系数见表2。

表2 目标物的线性回归方程和相关系数

由表2可知，2种无机砷分离度均大于1表明各个组分之间分离效果好，相关系数表明，各个组分峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，可以通过外标法定量。

当称样1.0 g时，亚砷酸盐As(Ⅲ)的检出限为0.015 mg/kg定量限为0.040 mg/kg，砷酸盐As(Ⅴ)的检出限为0.030 mg/kg定量限为0.080 mg/kg。

2.3 加标回收及精密度实验

采用在空白样品中添加标准溶液的方法，进行添加回收率重复性实验。空白样品选择阴性样品，配制高中低三个浓度回收率，分别取浓度为1 000 μg/L 的标准储备液0.04、0.1、0.4 mL加入样品中，冰箱冷藏保存20 h，再按照1.3.1进行样品前处理，重复做样品6次，进样量100 μL，检测样品重现性。结果见表3。

由表3可知，亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷回收率在85.0%～97.5%， RSD为0.6%～2.8%；说明该提取方法回收率高，重现性好，可用于大米中无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]检测。标准分离见谱图4。

表3 回收率与精密度结果

图4 无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]标准品分离色谱图

2.4 实际样品分析

对样品中亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)2种无机砷进行检测。谱图见图5。

图5 样品谱图

样品检测实验结论：此方法分离度高，灵敏度高，重现性好，可用于大米中无机砷[As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]的检测。

3 暴露评估模型结果与分析

大米作为辽宁地区的主食之一，成年男人每人每日摄入量为1 000 g左右,女人和儿童每人每日摄入量为300～500 g，虽然大米中砷酸盐、亚砷酸盐不是禁添加化合物，由于人均摄入量大，消费群体庞大，因此此次风险评估模型的建立按照砷酸盐、亚砷酸盐检出1种的概率建立，模型分别模拟出辽宁地区大型商场中的超级市场，小型农贸市场及早市大米中检出As (Ⅲ)或As(Ⅴ)]种类大于1的概率。

3.1 辽宁地区大米中亚砷酸盐As(Ⅲ)检出流行率模型建立

根据城市不同共采集样品200份，通过检出种类的统计，建立在辽宁地区亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的流行率模型，模拟为RiskTriang (0.02，0.04，0.07)。由模型得出，辽宁省亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的流行率=4.3%。

3.2 建立辽宁地区大型商场超市中大米的亚砷酸盐As(Ⅲ)检出率模型

通过调查得出辽宁省一般大型商场超市中大米制品的种类为50种左右(包括不同城市同一种产品的各种批次)，根据亚砷酸盐As(Ⅲ)的检出的流行率=0.043，在这50种样品中有一种样品亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的概率可以模拟为RiskBinomial(50,0.043) 。

由图6得辽宁地区大型商场超市中亚砷酸盐As(Ⅲ)样品检出率大于1的概率大于0小于5%。

图6 辽宁地区大型商场超市中有一种大米中亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的概率模型

3.3 建立辽宁地区小型农贸市场及早市中大米的亚砷酸盐As(Ⅲ)检出率模型

通过调查得出辽宁地区中，小型农贸市场以及早市中大米的种类为20种左右，根据大米产品流行率为4.3%，在这20种样品中有一种样品亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的概率可以模拟为RiskBinomial(20,0.043) 。

由图7得辽宁地区中、小型农贸市场及早市中亚砷酸盐As(Ⅲ)样品检出率大于1的概率大于0小于3%。

图7 辽宁省中、小型市场有一种大米中亚砷酸盐As(Ⅲ)检出的概率模型

3.4 辽宁地区大米中砷酸盐As(Ⅴ)检出率流行率模型建立

根据检出种类的统计，建立在辽宁地区砷酸盐As(Ⅴ)样品检出的流行率模型，模拟为RiskTriang (0.02，0.04，0.05)。由模型得出辽宁地区砷酸盐As(Ⅴ)检出的流行率=3.67%。

3.5 建立辽宁地区大型商场超市中大米的砷酸盐As(Ⅴ)检出率模型

通过调查得出辽宁地区大型商场超市中大米的种类为50种左右(包括不同城市同一种产品的各种批次)，根据砷酸盐As(Ⅴ)的流行率=0.037，在这50种样品中有一种样品检出砷酸盐As(Ⅴ)的概率可以模拟为RiskBinomial(50,0.037)。

由图8模型得辽宁地区一般大型商场超市中大米及制品中砷酸盐As(Ⅴ)检出种类大于1的概率大于0小于4%。

图8 辽宁地区大型超级市场有一种大米中检出砷酸盐As(Ⅴ)的概率模型

3.6 建立辽宁地区小型农贸市场及早市中大米的砷酸盐As(Ⅴ)检出率模型

通过调查得出辽宁省中，小型农贸市场及早市中，大米的种类为20种左右，根据大米产品流行率为3.67%，在这20种样品中有一种样品砷酸盐As(Ⅴ)检出的概率可以模拟为RiskBinomial(20,0.037)。

由图9得辽宁省一般中、小型市场及早市大米中检出砷酸盐As(Ⅴ)种类大于1的概率大于0小于2%。

图9 辽宁省中、小型市场有一种大米中亚砷酸盐As(Ⅴ)检出的概率模型

4 结论

1)通过上述评估模型结果表明，辽宁地区一般大型商场超级市场中大米中亚砷酸盐检出As(Ⅲ)种类大于1的概率小于5%，辽宁地区一般中、小型超级市场及早市中大米谷物制品中检出砷酸盐As(Ⅲ)种类大于1的概率小于3%，辽宁地区一般大型商场超市中市场大米产品砷酸盐As(Ⅴ)检测种类大于1的概率小于4%，辽宁地区一般中、小市场及早市中大米产品砷酸盐As(Ⅴ)检测种类大于于1的概率小于2%因此，推断出辽宁地区大型商场，小型农贸市场大米中亚砷酸盐As(Ⅲ)检出1种的平均概率小于4%，砷酸盐As(Ⅴ)检出1种的平均概率小于3%。

2)辽宁地区内陆城市，沿江中无机砷中亚砷酸盐As(Ⅲ)的检测率较低，而山城、沿海城市大米产品中亚砷酸盐As(Ⅲ)的检出率较高，由于亚砷酸盐As(Ⅲ)的较高的降解能力，随着大米产品储存，运输的时间的增加，亚砷酸盐As(Ⅲ)会转变成其他形态的砷，因此亚砷酸盐As(Ⅲ)的检出率会下降，虽然检测样品结果，各个组分均在限制以内，但沿海、山城地区的亚砷酸盐As(Ⅲ)检出率较高，虽然含量值不足以对人们的健康构成严重威胁，但较高的检出率应该使大众引起重视。