鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

殷 茵，张琰杰，闫艳新，任慧英，刘文华

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)可引起雏鸭急性高度致死性感染，尤其是3周龄内最易感，死亡率高达80%，给养鸭业造成了重大经济损失[1]。DHV可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个血清型，其中Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，Ⅱ型DHV和III型DHV属于星状病毒科禽星状病毒属鸭星状病毒(Duck astrovirus，DAstV)[2]。其中DHAV又根据基因同源性差异分为3个基因型，分别为1型DHAV、2型DHAV和3型DHAV[3]。目前临床鸭肝炎主要是由1型和3型DHAV引起[4]。我国临床上针对DHAV商品化的生物制品主要是1型DHAV弱毒苗，3型DHAV 疫苗还没有得到正式审批。由于3型DHAV的广泛存在，大部分种鸭场也会利用3型DHAV临床分离株制备自家灭活苗与1型DHAV疫苗同时免疫。商品鸭场为了预防鸭肝炎，通常在3～5日龄进行卵黄抗体注射，目前临床应用的也多是1型+3型的双联抗体，所以针对DHAV建立一种快速、敏感、特异的抗体检测方法是非常必要的。虽然有针对鸭肝炎病毒的商品化ELISA试剂盒，但价格昂贵。由于DHAV颗粒太小，不易得到纯化病毒，而以全病毒作为包被抗原对病毒的纯化要求又较高，本试验拟以表达蛋白作为包被抗原，建立一种检测DHAV抗体的间接ELISA方法，为临床种鸭免疫效果的判定及DHAV卵黄抗体效价测定提供方便。

1 材料

表达载体pCold TF,为TaKaRa公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,为Sigma公司产品；山羊抗鸭IgG酶标二抗,为美国KPL公司产品；鼠抗His标签单克隆抗体,为Top Science公司产品；3型DHAV双抗原夹心ELISA试剂盒,为上海岚派生物科技有限公司产品；其他试剂，均为Solarbio公司产品；试验用各类病毒阳性血清，为山东省农业科学院家禽研究所黄兵研究员惠赠。

2 间接ELISA方法的建立

2. 1 包被抗原和抗体最佳工作浓度确定 将实验室前期表达鉴定的DHAV的VP3蛋白通过切胶回收法进行纯化[5]。将纯化蛋白用包被液分别进行1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000的倍比稀释，加入酶标板中4 ℃包被过夜。PBST洗涤5次，300 μL/孔加入封闭液，37 ℃孵育1.5 h；洗涤后再100 μL/孔分别加入1∶50、1∶100、1∶200的阳性和阴性血清，每个稀释度做复孔；洗涤后按100 μL/孔分别加入0.2 μg/mL的山羊抗鸭IgG-HRP，37 ℃孵育1 h；洗涤后每孔加100 μL TMB显色液，室温避光显色15 min，每孔加50 μL 2 mol/L的H2SO4终止反应，立即在酶标仪上测定OD450值。根据阳性和阴性血清的OD450值，选取P/N最大时对应的包被抗原和血清稀释度作为最佳稀释倍数[6]。

2.2 酶标二抗最佳工作浓度确定 根据山羊抗鸭IgG-HRP酶标抗体说明书提供的工作浓度范围分别做1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500倍稀释，在已经确定的最佳条件下进行ELISA，比较各组阴阳性血清的OD450值和P/N值，确定酶标二抗最佳稀释倍数[7-8]。

2.4 特异性试验 用VP3重组蛋白建立的间接ELISA方法分别检测鸭流感、鸭瘟、黄病毒、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、鸭甲肝病毒1+3型以及阴性血清进行交叉反应性测定，每个样本重复2次。

2.5 敏感性试验 对3份不同的DHAV血清，从1∶100开始进行2倍倍比稀释，用建立的间接ELISA方法检测，以能检测出阳性的最大血清稀释度作为样品的最低检出量。

2.6 重复性试验 板内重复性试验：用同一批次纯化的VP3蛋白包被酶标板，应用建立的间接ELISA条件对3份不同的阳性血清进行检测，每份样品做5个平行孔，对结果进行统计学分析。板间重复性试验:用同一批次纯化的VP3蛋白但不同时间包被的酶标板，应用建立的间接ELISA方法对3份不同阳性血清进行检测，每份样品做5个平行孔，结果进行统计学分析。统计学分析方法：计算同一份血清变异系数CV%，以检验板内和板间检测样品的重复性。

2.7 间接ELISA与双抗原夹心ELISA符合率试验 取40份免疫鸭血清分别用建立的间接ELISA方法和商品化的双抗原夹心ELISA试剂盒进行抗体检测，比较两者诊断的敏感性(即阳性检出率)、特异性(2种检测方法阴性率的比值)、符合率(2种检测方法阴性和阳性符合份数之和与总份数的比值)[8]。

3 结果

3.1 VP3重组蛋白的纯化 3型DHAV的VP3蛋白的纯化结果见图1。由图1可知，切胶纯化后获得了与预期大小一致的78 kD的VP3重组表达蛋白，经蛋白浓度测定仪测定浓度为319 μg/mL。

图1 纯化VP3蛋白的SDS-PAGE结果Fig.1 SDS-PAGE results of purified VP3 proteinM： 标准蛋白分子质量； 1： 纯化的VP3蛋白M： Protein standards； 1： Purified VP3 protein

3.2 包被抗原和抗体最佳工作浓度测定结果 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的测定结果见表1。由表1可见，VP3蛋白包被浓度为0.159 5 μg/mL，血清稀释1∶200倍时，阳性血清OD450值(P)为1.144，阴性血清OD450值(N)为0.355，P/N值最大。因此选择最佳抗原包被浓度为0.159 5 μg/mL，血清稀释度为1∶200。

表1 包被抗原和抗体最佳工作浓度测定结果Table 1 Results of determination of optimal working concentration of coated antigen and antibody

3.3 酶标二抗最佳工作浓度测定 酶标二抗各稀释倍数结果如表2所示，当酶标二抗稀释至1∶500时，P/N比值最大，确定其最佳工作浓度为0.2 μg/mL。

表2 最佳酶标抗体工作浓度的确定Table 2 Determination of the optimal working concentration of enzyme-labeled antibody

3.5 特异性试验 按照建立的间接ELISA方法进行特异性交叉试验，检测结果见表4。结果显示VP3蛋白能够与1型DHAV、3型DHAV以及1+3型DHAV阳性血清表现为阳性反应，说明该方法可同时检测1型与3型DHAV血清抗体。与鸭瘟病毒、鸭流感病毒和鸭黄病毒的阳性血清没有交叉反应，说明该方法的特异性良好。

表3 未免疫鸭血清的DHAV抗体检测结果Table 3 DHAV antibody test results in unimmunized duck serum

表4 交叉反应性检测结果Table 4 Cross-reactivity test results

3.6 敏感性试验 检测结果显示5份血清1∶800稀释的OD450值均大于临界值0.405，间接ELISA方法的灵敏度为1∶800(表5)。

表5 间接ELISA方法敏感性检测Table 5 Indirect ELISA method sensitivity detection

3.7 重复性试验 按照建立的间接ELISA方法检测3份血清，板内重复性试验结果如表6所示，板内变异系数在4.95%～6.57%，均小于10%；板间重复性试验结果如表7所示，板间变异系数在5.73%～8.30%，均小于10%。说明建立的ELISA方法具有较好的板内重复性和板间重复性。

表6 板内变异系数的测定Table 6 Determination of the coefficient of variation in the plate

表7 板间变异系数的测定Table 7 Determination of coefficient of variation between plates

3.8 间接ELISA与双抗原夹心ELISA符合率试验 用商品化的双抗原夹心ELISA试剂盒与本试验建立的间接ELISA方法同时检测40份临床免疫鸭血清，检测结果见表8。由表8可知，商品化的双抗原夹心ELISA试剂盒与本试验建立的间接ELISA检测阳性率分别为65%(26/40)和62.5%(25/40)。有1份双抗原夹心ELISA检测阴性血清，间接ELISA检测呈阳性；有2份双抗原夹心ELISA检测阳性血清，间接ELISA检测呈阴性。以双抗原夹心ELISA为参考，间接ELISA的诊断敏感性和诊断特异性分别为92.3%(24/26)和92.9%(13/14)。所以本试验建立的间接ELISA与双抗原夹心ELISA的符合率为92.5%。

表8 间接ELISA与双抗原夹心ELISA的符合率Table 8 Consistency of indirect ELISA and dual antigen sandwich ELISA

4 讨论

全病毒包含该病毒的所有抗原位点，而表达蛋白仅包含部分抗原位点[9]，因此在建立间接ELISA方法时将全病毒作为包被抗原比包被蛋白效果要好。对鸭肝炎病毒来说，由于病毒粒子太小，很难达到理想的纯化效果，因而常规的琼脂扩散试验不适于DHAV的抗体检测，ELISA方法灵敏度较高，但同样存在包被抗原制备困难的问题，所以迫切需要寻找能够代替全病毒的抗原。重组蛋白因其容易表达和纯化，并具有良好免疫反应的特点成为一种最佳选择。目前，以重组蛋白作为包被抗原的ELISA方法已得到广泛应用[10-11]，但报道的方法基本是用1型DHAV的VP3蛋白[12-13]，未见有将3型DHAV的VP3蛋白用于建立间接ELISA检测鸭甲肝病毒抗体的报道。特异性试验结果表明，本试验表达的VP3蛋白能同时跟1型和3型DHAV阳性血清反应，说明本试验建立的间接ELISA方法能同时检测1型和3型DHAV抗体。

理论上讲，间接ELISA可出现阳性和阴性2种结果，但实际检测中会有少量样本检测值位于阴、阳性的分界处，难于准确判断。科学合理的判定临界值对保证试验结果的准确性至关重要。本试验应用40份健康鸭阴性血清进行了检测与分析，得出阴、阳性血清的临界值为0.405。因血清来源和数量有限不能够代表全部健康鸭的血象特征，因此本试验设定的临界值还需要在今后大量的应用中进一步完善。根据建立的ELISA方法及最佳反应条件，确定该方法的特异性，结果表明，本试验建立的间接ELISA方法可用于鸭肝炎病毒抗体水平的检测。

本试验以3型DHAV的VP3表达蛋白作为包被抗原建立的检测鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。与商品化的双抗原夹心ELISA方法的符合率为92.5%。