SWELL1真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞的表达

夏忠雪，王 胜，周雁红，林小珍，姜晓明，丁 旭，聂文营，郝 峰

(1.吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 132013 ； 2.吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130021 ； 3.北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

容积调控性阴离子通道(Volume-regulated anion channels, VRAC)普遍存在于哺乳动物细胞，参与多种生命活动，如调节细胞容积动态平衡、维持细胞自身内环境的稳态、辅助运输代谢物或药物和细胞外信号转导，与细胞的电生理、细胞增殖与分化以及细胞的凋亡等多种生命活动密切相关[1]。且与肿瘤、心肌缺血、心律失常等多种疾病的发生存在必然的联系[2-4]。2014年《科学》和《细胞》杂志分别发表文章证实SWELL1是容积调控氯离子通道的重要组成部分，为深入研究容积调控性氯离子通道提供了便利条件。但是，目前对于SWELL1容积调控性氯离子通道的认识尚存在局限性[5-7]。

本试验构建SWLL1真核表达载体，脂质体转染，观察SWELL1容积调控性氯离子通道在多种哺乳动物细胞的表达情况(如：FRT、HEK293、CHO等)，荧光淬灭动力学试验检测SWELL1的功能，获得用于研究SWELL1的最佳细胞模型。本试验结果为研究SWELL1生理特性，以及后续筛选SWELL1调节剂、发现SWELL1关键碱基和氨基酸、研究SWELL1与某些生理活动和病理机制的内在联系等，提供了重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 真核表达载体pCMV3-RFP由中国科学院关新刚教授馈赠，YFP-H148Q /I152L真核表达载体由本实验室前期构建，所用引物由南京诺唯赞公司合成。Lipofectamine 2000脂质体，购自Invitrogen公司；同源重组酶，购自南京诺唯赞公司；尼氟灭酸(Niflumic acid，NFA)，购自Sigma公司；F-12Ham′s营养培养基，购自Sigma公司；Hygromycin B和G418抗生素，购自Invitrogen公司；血清，购自Gibco公司；FRT、HEK293、CHO细胞由本实验室保存。

1.2 主要仪器 Fluo star多功能酶标仪(德国BMG公司)；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；超纯水机(美国Millipore公司)；凝胶成像仪(美国Biorad公司)；PCR仪(美国ABI公司)；Nanodrop 2000(美国Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 SWELL1真核表达载体的构建和鉴定 UniGene数据库查询SWELL1在人体多种组织细胞中的表达情况，并选取表达量最高的SJSA1软骨肉瘤细胞作为目的基因SWELL1的来源。取密度90%SJSA1细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度；GenBank数据库查询ID为NM_019594.3的SWELL1序列编码区全长，南京诺唯赞公司CE Design软件设计引物，下游引物去除终止密码子，使其C端的ORF表达，上游引物:5′- TTCGAACCACCGCCGGGGATGATTCCGGTGACAGAGCT-3′，下游引物:5′-GGCCTGCTCCTTGTCAGCTGCAAGAGTCACGATAG-3′；参照试剂盒说明书以总RNA为模板逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收；EcoRⅤ和NheⅠ双酶切获得带有同源臂的线性载体；同源重组酶连接回收产物与载体；重组质粒导入DH5α大肠杆菌感受态，涂布含有卡那霉素的固体培养基平板中，次日挑取阳性单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基扩大培养，参照试剂盒说明书提取质粒，测序鉴定。

1.3.2 稳定表达SWELL1和YFP-H148Q/I152L细胞株的建立 按照Lipofectamine 2000 Reagent说明书将SWELL1分别转入FRT、HEK293、CHO细胞，Hygromycin B抗生素筛选，挑取倒置荧光显微镜下细胞膜可见红色荧光的细胞克隆(FRT细胞)，有限稀释后保存阳性细胞株，连续传代3次仍有百分之百细胞膜上可见红色荧光的FRT细胞为稳定表达SWELL1的阳性细胞株，扩大培养。将YFP-H148Q/I152转入已表达SWELL1的FRT细胞，用G418抗生素筛选，挑取倒置荧光显微镜下胞浆可见绿色荧光信号的FRT细胞克隆，具体步骤同上，获得SWELL1和YFP-H148Q/I152L共表达的FRT细胞株。

1.3.3 反转录PCR鉴定SWELL1 mRNA的表达 选取稳定表达SWELL1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞株，弃去培养液, 加入 TRIzol，按照试剂盒说明书提取总RNA，以总RNA为模板合成cDNA。取此cDNA为模板， 以SWELL1编码区特异性引物PCR扩增目的片段；上游引物：5′-CTGAACCGCAACAAGATCGA-3′，下游引物：3′-CGCCCACCCTGGAGGGC-5′；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，测序鉴定。

1.3.4 卤族元素敏感的YFP-H148Q /I152L荧光淬灭动力学试验 选取传代2次后状态较好的共表达SWELL1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞株，传代到96孔板，用PBS清洗3遍去除杂质，PBS全部吸出后，进行2组试验：第1组加入50 μL超纯水，隔2 s由酶标仪注入碘离子的PBS缓冲液，记录相对荧光强度；第2组加入50 μL含300 μmol/L的NFA抑制剂，孵育10 min后全部吸出，加入50 μL超纯水，隔2 s由酶标仪注入碘离子的PBS缓冲液，记录相对荧光强度。具体设置如下:激发光波长500 nm，发射光波长540 nm。以每秒5个点的速度动态检测相对荧光强度，其中前2 s为基线，2 s后以280 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL碘离子PBS缓冲液。500 mL 137 mmol/L NaI PBS缓冲液的配方如下：137 mmol/L NaI 10.27 g、2.7 mmol/L KCl 0.1 g、1.0 mmol/L CaCl20.055 g、0.5 mmol/L MgCl20.051 g、8.1 mmol/L Na2HPO40.575 g、1.5 mmol/L KH2PO40.102 g。

2 结果

2.1 SWELL1真核表达载体的构建 UniGene数据库获得SWELL1容积调控性氯离子通道在人体肿瘤组织的最佳表达量为软骨肉瘤细胞(表1)；挑选阳性克隆送公司测序，部分测序结果如中插彩版图1，测序结果与 GenBank 数据库获得的SWELL1序列比对完全一致，比对结果略。结果表明成功构建SWELL1真核表达载体。

表1 SWELL1在人体的多种组织细胞中的表达Table 1 The expression of SWELL1 in various human tissue and cells

2.2 细胞模型的构建 倒置荧光显微镜下观察，可见FRT细胞膜上有清晰的红色荧光(见中插彩版图2)，表明SWELL1表达于FRT细胞膜。CHO和HEK293胞浆有红色荧光，表明SWELL1表达在CHO和HEK293细胞胞浆。结果证实，SWELL1可清晰表达于FRT细胞膜，FRT细胞是一种用来表达SWELL1以利于后续深入研究其功能的良好细胞模型。

2.3 细胞模型表达SWELL1的检测 反转录PCR电泳结果显示，在 250 bp 附近出现特异性条带，与预期的目的片段大小相符(中插彩版图3A)；并对PCR产物切胶回收后测序，部分测序结果见中插彩版图3B，测序结果与 GenBank 数据库获得的SWELL1序列比对，比对结果表明，FRT细胞在mRNA水平表达SWELL1，SWELL1目的基因成功稳定转染至FRT细胞。

2.4 SWELL1转运阴离子的试验 多功能酶标仪荧光淬灭动力学试验结果显示(图4)，用低渗溶液作用SWELL1后，随着NaI缓冲液的加入相对荧光强度显著性下降，提示SWELL1开放，碘离子内流。而加入抑制剂NFA后，相对荧光强度无显著性变化，提示SWELL1阴离子通道不开放。结果表明，SWELL1容积调控性氯离子通道具有转运碘离子的功能，且转运阴离子的功能可被氯离子通道抑制剂所抑制。

图4 荧光淬灭动力学试验鉴定SWELL1的功能Fig.4 The results of fluorescence quenching kinetic experiments identify SWELL1 functionsA: 低渗状态下相对荧光强度的变化； B: 氯离子通道抑制剂NFA对SWELL1离子转运功能的影响A:The result of relative fluorescence intensity in low osmotic pressure; B:The effect of chloride channel inhibitor NFA on SWELL1 ion transport function

3 讨论

阴离子通道根据其门控机制分为电压门控阴离子通道、囊性纤维化跨膜传导调节因子、钙离子激活阴离子通道、配体激活的阴离子通道和容积调控性阴离子通道[8-9]。相对其他阴离子通道而言，对容积调控性氯离子通道的认知尚有不足。2014年《科学》和《细胞》杂志分别证实SWELL1是容积调控氯离子通道的重要组成元件，为深入研究容积调控性氯离子通道提供了不容忽视的帮助[5-7]。SWELL 1是体积调节阴离子通道(VRAC)的必需亚基，调节细胞的体积平衡，并被低渗溶液激活[10]。SWELL 1与其他4位家族成员一起，可能形成一组具有不同性质的VRAC通道，但SWELL 1本身也具有功能[11]。

本试验通过同源重组成功构建SWELL1真核表达载体，利用可灵敏特异反映其开放情况的YFP-H148Q/I152L进行荧光淬灭动力学试验寻找一种较好的可表达SWELL1的细胞，并利用该细胞鉴定SWELL1的功能。有研究证实，YFP-H148Q/I152L是一种黄色荧光蛋白的突变体，对于碘离子的具有极高的敏感性，微量的碘离子就可使其荧光迅速发生淬灭，通过Fluostar多功能酶标仪可快速准确的反应其相对荧光强度[12-13]。本试验结果表明：SWELL1表达于FRT细胞膜，是一种比较适合用于表达SWELL1的细胞；FRT细胞贴壁较紧，利于荧光淬灭动力学试验的进行；低渗状态下，荧光信号发生淬灭，证实SWELL1容积调控性氯离子通道具有转运阴离子(如碘离子)的功能；SWELL1是容积调控性阴离子通道不可或缺的一部分，本试验获得的模型可敏感地反映SWELL1容积调控性阴离子通道的开放情况，可反复传代，具有传统电生理技术不可比拟的优点，且通过荧光淬灭动力学试验证实了SWELL1是容积调控氯离子通道的编码基因，为后续SWELL1调节剂筛选、SWELL1关键碱基和氨基酸的发现、SWELL1与某些生理活动和病理机制的内在联系等研究奠定了良好基础。