苍蝇中产耐NDM型碳青霉烯类肠杆菌的流行情况与耐药性分析

翟卫帅，樊 润，王晓明，李基云，刘 晓，刘德俊，刘志海,，汪 洋，张启迪

(1. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109 ； 2. 中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

碳青霉烯类药物是临床上治疗多重耐药革兰阴性菌感染的特效药物之一[1]。但2009年在印度发现携带新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)的细菌(“超级细菌”，Superbug)[2-3]，几乎能对所有β-内酰胺类药物耐药(包括被认为是“最后一道防线”的碳青霉烯类)，曾一度引起人们的恐慌[4]。迄今为止，世界上已经发现了OXA、KPC、VIM、IMP、NDM等数十种碳青霉烯酶，其中NDM是流行范围最广和药物水解活性最好的金属β-内酰胺酶[5]。令人担忧的是，NDM已发现了21种变异体，且有向更强耐药性进化的趋势[6-7]。

近15年以来，铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌等各类碳青霉烯类耐药菌(Carbapenem-resistant bacteria，CRB)已在全球广泛传播，并表现出严重的多重耐药性，临床治疗时可选择的有效抗菌药物少，且治疗难度巨大，被视为是进入“后抗菌药物时代(无抗菌药物可用的时代)”的重要标志[8-9]。特别是碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)不再局限于院内传播，还在各种环境中传播，危害严重[10-11]。尽管国内外均未批准碳青霉烯类药物在动物养殖业上使用，但这并没有阻止畜禽源CRE的出现与蔓延[11]。现有证据表明，携带多重耐药细菌的昆虫和候鸟是导致细菌耐药基因跨地区快速传播的重要原因之一[5]，尤其是苍蝇[1]。苍蝇是一种杂食性昆虫，能够在不同环境中传播病毒、细菌等各种病原，是人类疾病传播的重要媒介之一[12-13]，也是肉鸡养殖场内产NDM碳青霉烯类肠杆菌科细菌(NDM-carbapenem-resistant enterobacteriaceae，NDM-CRE)传播的重要媒介之一[1, 14]。但是现有报道仅有养殖场中苍蝇传播一些多重耐药菌的零星报道[1, 12-13]，并没有养殖场外苍蝇中NDM-CRE的相关报道。因此，本研究拟通过对2016年9月-2017年9月期间山东青岛某肉鸡养殖场周边苍蝇中NDM-CRE流行情况的调查，明确苍蝇NDM-CRE在养殖场外传播的作用，为进一步阐明苍蝇将NDM-CRE传播至肉鸡养殖场分子机制奠定材料基础和数据支持，同时也为细菌耐药性的传播与控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 2016年9月-2017年9月期间，在山东青岛某规模化肉鸡养殖场周边约15～25 m远设置8～10个采样点，每个采样点间隔10～15 m远，并利用粘蝇板收集苍蝇样本。当粘蝇板上苍蝇数量大于10只时，用消毒镊子夹取苍蝇样本置于E-swab管中，每个点采3个样品。

1.2 主要试剂 KPC显色培养基及增补剂，均购自郑州博赛生物技术股份有限公司；脑心浸液培养液、脑心浸液琼脂、M-H琼脂、M-H肉汤，均购自北京陆桥技术有限责任公司；E-swab管，购自上海富雪生物技术有限公司；2×TaqMaster Mix (Dye Plus),购自南京诺唯赞生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 抗菌药物 氨苄西林(AMP)、阿莫西林/克拉维酸钾(2∶1)(AMC)、头孢唑啉(CZO)、头孢西丁(FOX)、头孢噻呋(CEF)、美罗培南(MEM)、氨曲南(ATM)、恩诺沙星(NOR)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、土霉素(OTC)、替加环素(TGC)、氟苯尼考(FFC)、氯霉素(CHL)、多黏菌素E(COL)、复方新诺明(SXT)，均购自中国兽医药品监察所。

1.4 细菌分离及保存 增菌：从E-swab管中吸取10 μL样本液于1 mL无药的BHI肉汤中，37 ℃过夜静置培养；分离：用无菌接种环蘸取培养后菌液于含0.04 μg/mL增补剂的KPC显色培养基划线培养，37 ℃静止培养14～16 h；初纯化：根据KPC显色培养基说明书挑取不同颜色的单克隆于含1 μg/mL美罗培南的脑心浸液琼脂划线，37 ℃过夜培养；纯化及保存：挑取单克隆于含1 μg/mL美罗培南的1 mL BHI肉汤中，37 ℃过夜静置培养，加500 μL 60%的甘油，保存于-80 ℃冰箱中。

1.5 细菌种属鉴定与耐药基因检测 细菌基因组提取按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。细菌种属鉴定通过16S rRNA测序并与NCBI数据库相应序列比对确认，通过PCR方法检测所有NDM-CRE分离株携带的关键耐药基因(引物序列信息见表1)并测序确认。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.6 药敏试验及结果判定标准 参考CLSI(Clinical and laboratory standards institute，美国临床和实验室标准协会)[15]和EUCAST(European committee on antimicrobial susceptibility testing，欧洲药敏试验联合委员会)[16]推荐的微量肉汤稀释法与判定标准，测定NDM-CRE分离株对氨苄西林等16种抗菌药物的敏感性，以ATCC25922为质控菌株。

表1 本研究中用到的PCR引物序列信息Table 1 PCR primers for this research

2 结果

2.1 NDM-CRE分离鉴定 2016年9月-2017年9月对青岛某肉鸡养殖场周边进行了4次苍蝇采集，共收集了120份样本。利用KPC显色培养基筛选鉴定出31株CRB(分离率为25.8%)，经16S rRNA种属鉴定出16株为CRE(分离率为13.3%)、15株为非肠杆菌科细菌(分离率为12.5%)(表2)。对16株CRE进行blaNDM基因检测发现,所有分离株均为NDM阳性，分别是大肠杆菌10株(分离率为8.3%)，弗氏柠檬酸杆菌5株(分离率为4.2%)，肺炎克雷伯菌1株(分离率为0.8%)。

表2 120份苍蝇样本中CRB的分离鉴定结果Table 2 Isolation and identification of CRB in 120 fly samples

2.2 NDM分型 对16株NDM-CRE分离株进行NDM亚型鉴定，发现仅有NDM-5与NDM-9两种亚型(表3)，62.5%(10株)的分离株为NDM-5，37.5%(6株)的分离株为NDM-9。10株NDM-5菌株分别是弗氏柠檬酸杆菌5株、大肠杆菌4株和肺炎克雷伯菌1株；6株NDM-9分离株均为大肠杆菌。

2.3 抗菌药物敏感性测试 对16株CRE分离株进行16种抗菌药物敏感性测试，结果发现，所有分离株除了对替加环素敏感外，对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸钾(2∶1)、美罗培南、头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻呋、四环素、土霉素和复方新诺明均耐药；对氟苯尼考、氯霉素、庆大霉素、恩诺沙星和氨曲南的耐药率高，分别为93.8%(15/16)、93.8%(15/16)、87.5%(14/16)、87.5%(14/16)和46.7%(7/16)(表3)； 18.8%(3/16)的分离株对多黏菌素E耐药。进一步分析发现，所有分离株至少耐11种抗菌药物(图1)。其中，以耐14种抗菌药物的菌株数量最多(6株，占37.5%)，其次是耐13种抗菌药物的菌株(5株，占31.3%)。

2.4 其他类型耐药基因 对16株CRE分离株进行12种关键耐药基因的检测。结果发现，所有分离株均能够检测出5种或5种以上的耐药基因(表3)。耐药基因检测结果显示，所有分离株均携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM-1基因，分别有31.3%(5/16)和12.5%(2/16)的分离株携带blaCTX-M-15和blaCTX-M-132基因；氨基糖苷类耐药基因rmtB与四环素类耐药基因tet(A)的检出率均为56.3%(9/16)，同时有25%(4/16)的分离株还同时携带有四环素类耐药基因tet(A)和tet(B)；酰胺醇类耐药基因floR和磺胺类耐药基因sul1的检测率也为100%(16/16)，同时还有93.8%(15/16)的磺胺类耐药菌株同时携带sul1和sul2基因，有43.8%(7/16)的菌株同时携带sul1、sul2和sul3基因；多黏菌素耐药基因mcr-1的检测率为18.8%(3/16)。

图1 16株NDM-CRE分离株多药耐药性情况Fig.1 Multidrug resistance of 16 NDM-CRE isolates

3 讨论

目前，国内外关于苍蝇源NDM-CRE的报道较少。有限的报道显示，我国肉鸡养殖场内苍蝇的流行率为25.8%(31/120)[1, 14]，比本研究中肉鸡养殖场外的分离率13.3%(16/120)略高，且介于养殖场肉鸡中NDM-CRE的分离率(3.1%～33.2%)[1, 23]；这可能与肉鸡养殖场中还有其他的传播媒介(如狗、家燕等[1, 5, 14])有关，亦可能是养殖场中携带NDM-CRE的苍蝇向养殖场周边扩散的缘故，或者是养殖场外携带NDM-CRE的苍蝇进入场内并在肉鸡中定植后克隆传播引起的。此外，现有研究表明，养殖场内鸡源CRE主要是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，苍蝇中流行菌属主要为大肠杆菌[1, 5, 14]；本研究则发现苍蝇中弗氏柠檬酸杆菌是仅次于大肠杆菌的流行菌株，说明弗氏柠檬酸杆菌可能是苍蝇中NDM-CRE的主要流行菌株之一，这可能与苍蝇的采食习性有关。值得注意的是，本研究中苍蝇携带的blaNDM-5与blaNDM-9两种耐药基因与我国肉鸡养殖场内鸡与苍蝇中携带的NDM-CRE的主要流行型一致[1, 5, 14]，这说明了肉鸡养殖场周边苍蝇是NDM-CRE的重要储库和传播媒介，它的存在可能进一步促进了NDM-CRE的跨区域传播，加剧了细菌耐药性扩散的风险。

关于鸡源CRE也仅有零星报道，有研究表明，我国7省15个肉鸡养殖场中产NDM-5型CRE菌株对碳青霉烯类、头孢类、青霉素类、氟喹诺酮类、磺胺类抗菌药物完全耐药(18/18)，对酰胺醇类(88.9%，16/18)、氨基糖苷类(44.4%，8/18)和多黏菌素(33.3%，6/18)抗菌药物的耐药率也比较高[23]；刘志海的研究也发现，NDM型CRE菌株(100%，45/45)对碳青霉烯类、头孢类、青霉素类和氟喹诺酮类抗菌药物完全耐药，对氨基糖苷类和多黏菌素的耐药率分别达到了82.2%(37/45)、66.7%(30/45)[5]。这些报道均显示，我国鸡源NDM阳性CRE分离株具有相当严重的多重耐药性，这与本研究中肉鸡养殖场外苍蝇中携带的分离株耐药性极其相似，究其原因则是这些分离株携带了多重耐药基因或是同时携带多种耐药基因的缘故。值得注意的是，多黏菌素是临床上治疗CRE等多重耐药革兰阴性菌的保留用药，但近年来由于可转移黏菌素耐药因子MCR的出现和蔓延[22]，导致肠杆菌对其耐药率不断上升，进一步加剧了治疗CRE等多重耐药菌株感染时的抗菌药物选择危机。本研究发现了3株多黏菌素耐药的CRE菌株，这需要引起高度重视。

由于细菌耐药机制比较复杂，同一耐药表型可能有多种耐药机制引起[5]，因此在本研究中仅对CRE菌株常见的12种关键耐药基因(除blaNDM外)进行了检测。耐药基因检测结果表明，所有分离株至少携带有5种耐药基因，有的甚至多达9种耐药基因，甚至有些有耐药表型的菌株未能够检测到相应耐药基因，表现出了较为复杂的耐药机制。尤其需要引起重视的是苍蝇中有3株同时携带了耐药基因blaNDM和mcr-1的CRE分离株，一旦这些菌株通过苍蝇传递给食品或是人类，将会对食品安全与人类健康造成较大风险。因此，养殖业中需要对养殖场内外环境中的苍蝇等传播媒介予以消灭，以达到对耐药基因这一新型环境污染物的控制，降低养殖业对环境的污染和公共卫生安全的风险。