宏基因组分析面部脂溢性皮炎的菌群变化

钟彩梅, 郑秀芬， 黄桃源， 潘惠娟, 邓裕华， 何仁亮

(1.佛山市顺德区慢性病防治中心皮肤科, 广东 佛山 528399; 2.南方医科大学顺德医院皮肤科，广东 佛山 528308； 3.南方医科大学皮肤病医院皮肤外科与皮肤肿瘤科，广东 广州 510091； 4.南方医科大学公共卫生学院预防医学实验教学中心，广东 广州 510515)

人体皮肤表面存在大量微生物，如细菌和真菌[1]。细菌群落主要以痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)为主，而真菌群落主要以球形马拉色菌(Malasseziaglobosa)为主[1]。目前，脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis, SD)皮损处是否存在菌群失调尚不清楚，且M.globosa一直以来被认为是引发SD的主要致病菌[2-3]。有研究发现运用抗真菌药物治疗SD患者后，皮损处球形马拉色菌的含量先减少，停药后逐渐升高[4]。因此，SD与微生物之间的相互关系仍需进一步探讨。

随着高通量测序技术的发展，人体的皮肤[5]、肠道[6]、呼吸道[7]、阴道[8]等组织器官被发现存在有大量的微生物,这些微生物与人体的健康和疾病息息相关[9-12]。为了探索SD患者与健康人群之间的微生物差异，本研究通过宏基因组测序对SD皮损处皮肤微生物样品进行了分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2017年4月—2018年8月本院皮肤科门诊的SD患者及健康志愿者。SD组纳入标准：①符合SD的诊断标准[13]；②治疗前3～4周内未使用过抗生素、维甲酸类、性激素、皮质类固醇激素等药物治疗。排除标准：①妊娠期及哺乳期患者；②患有高血脂、肝肾功能异常、痤疮、玫瑰痤疮、接触性皮炎等疾病者；③面部使用护肤品者。健康组纳入标准：①面部无炎症性表现(即红、肿、热、痛等)；②无吸烟史;③近1月内面部未使用过抗生素、维甲酸类、激素等药物；④非妊娠期及哺乳期者；⑤无高血脂、肝肾功能异常等系统性疾病。受试者均签署知情同意书,研究获得本院伦理委员会批准。

共纳入SD患者17例，其中男7例，女10例；年龄26～40岁，平均29.9岁；主要表现为反复面部毛孔粗大，皮肤油腻，红斑，脱屑3个月～1年，部分患者出现毛细血管扩张。健康组共20例，其中男10例，女10例，年龄28～35岁，平均32岁。两组年龄(t=1.51,P=0.139)及性别(2=0.23,P=0.592)差异无统计学意义。

1.2 试剂及仪器

蛋白酶K(美国Thermo Fisher Scientific)、DNA提取试剂盒(MasterPure DNA and RNA Purification Kit, 英国Epicentre)、HiSeq PE Cluster V4试剂盒(美国Illumina)、HiSeq SBS V4 250 cycle试剂盒(美国Illumina)、KAPA LTP文库纯化试剂盒(美国Kapa Biosystems)。无菌MF滤膜(REF:HAWP01300，直径0.45 μm，美国Merck Millipore)、超声碎裂仪(Bioruptor PLUS/pico，比利时Diagenode)、Illumina测序仪(HiSeq2500,美国Illumina)。

1.3 方法

1.3.1 皮肤微生物样品的采集 采用无菌有齿镊夹住无菌MF滤膜,紧贴受试者面颊部皮肤表面来回摩擦5～10次，随即将此MF滤膜放入含有1 μL蛋白酶K和300 μL组织和细胞裂解液的无菌Eppendorf管中。设立3个未接触皮肤的无菌MF滤膜为阴性对照。样品保存于-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 DNA提取及宏基因组测序 提取皮肤微生物DNA，操作按试剂盒说明书进行。采用超声碎裂仪将总量约100 ng的DNA碎裂成长度为300～400 bp的DNA片段；采用KAPA LTP文库纯化试剂盒进行DNA测序文库的构建。使用HiSeq PE Cluster V4试剂盒和HiSeq SBS V4 250 cycle试剂盒对DNA文库进行双端测序。测序结束后利用软件CASAVA v1.8.2 (美国Illumina)对原始数据进行Fastq格式的转换。3个阴性对照的测序样品亦同步进行文库构建、测序及分析。样品采集及DNA测序的方法参考Oh等[1]研究。测序由中山大学中山眼科中心魏来教授课题组完成。

1.4 数据分析及统计学处理

使用质量控制软件(FastQC, Cutadapt, Fastx, PrinSeq)对数据进行质控分析，在得到的高质量数据中去除来源于人细胞的测序数据，得到不含有宿主数据的高质量微生物数据，通过软件HiSAT2 (v2.0.1)在通用微生物数据库中比对该高质量微生物数据，对成功匹配的微生物基因组进行物种注释，并采用RPKM法标准化计算相对丰度。物种构成比=各物种的reads数目/总微生物reads×100%。采用R软件(v3.4.3)分析基于菌种相对丰度的主成分分析(principal component analysis，PCA)，以PC1的数值计算β-多样性的P值，间接反映组间物种相对丰度的差异。采用Mothur软件计算香农指数(shannon index)以评估微生物α-多样性，衡量微生物种类多样性。采用线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)，通过Lefse程序计算组间差异微生物的相对丰度，获得各组数据中具有代表性且差异显著的菌种。由软件bedtools (v2.19.1)计算获得细菌基因组的覆盖度(Coverage)。采用R软件(v3.4.3)中的pROC脚本命令，利用各样品中P.acnes的相对丰度计算ROC曲线，并依据ROC曲线的判定结果，假定当P.acnes的相对丰度<80%时，皮肤微生态结构出现菌群失调。比较发生菌群失调的SD组样品、未发生菌群失调的SD组样品与健康组之间α-多样性和β-多样性的差异。

所有数据采用GraphPad Prism统计软件进行统计学处理。健康组和SD组间各微生物含量的比较、痤疮丙酸杆菌相对丰度的比较、香农指数及β-多样性的比较采用t检验；不同皮肤部位微生物结构比较采用one-way ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宏基因组测序分析健康组及SD组面部皮肤微生物数据

健康组样品的总测序reads数据为42.2～67.2 M，源自人细胞的数据平均约占35.7%，每个样品可获得约3.2～13.4 M高质量的微生物reads数目，占总测序reads数目的4.8%～26.6%。SD组样品的总测序reads数据为28.1～84.6 M，源自人细胞的数据平均约占45.1%，每个样品可获得约1.9～20.4 M高质量的微生物reads数目，占总测序reads数目的2.8%～34.6%。3个阴性对照的测序样品均为重复、无效的数据或低质量的数据，且未获得足够的可用于分析的微生物数据，因此该数据不展示。

2.2 不同部位皮肤微生物PCA分析

分析SD好发部位皮肤的微生物群落结构，结果示大部分无炎症的皮肤组织之间的微生态结构存在差异(F=3.05,P=0.009)，而面部的3个不同部位，如脸颊、眉弓和鼻唇沟的微生态结构最为相似(F=1.10，P=0.341)，见图1A、1B。

图1 不同SD好发部位(1A)及面部SD好发部位(1B)皮肤微生物的PCA分析(原始测序数据从NCBI数据库下载)

2.3 健康组与SD组面颊部皮肤微生物的组成比较

比较健康组与SD组之间面颊部皮肤微生物的相对组成，结果显示，与健康组相比较，SD组的细菌相对含量下降(t=2.59,P=0.014)，而古生菌(t=2.23,P=0.033)与真菌(t=3.14,P=0.003)的相对含量升高，病毒的相对含量无明显变化(P=0.091)，见图2A。细菌的减少以P.acnes减少为主(t=2.69，P=0.012)，见图2B。但SD组中细菌相对含量仍高达70.3%，为主要微生物(图2C)。通过PCA分析两组中各微生物的β-多样性，结果显示，相较于健康组，SD组细菌的β-多样性发生改变(t=2.28，P=0.029)，而真菌(t=0.82，P=0.416)、病毒(t=0.16，P=0.870)的β-多样性均无明显差异(图2D)。

2.4 SD患者皮损处的菌群失调及与健康组α-多样性、β-多样性比较

依据ROC曲线结果(图3A)，SD组中有6个样品出现菌群失调，与健康组(随机选择6个样品)相比较，发生菌群失调的SD组样品的细菌α-多样性(t=3.14，P=0.011)和β-多样性(t=5.34，P<0.001)均发生改变(图3B、3C)；而未出现菌群失调的SD组样品的细菌α-多样性(t=1.98，P=0.060)和β-多样性(t=1.56，P=0.133)与健康组无差异(图3D、3E)。

2.5 SD患者皮损LDA分析

LDA分析发现在菌群失调的SD样品中有36种细菌的相对含量较健康组升高(图4A)。通过计算这36种细菌在各个样品中的基因组覆盖度，并结合ROC曲线的结果(表1)，当基因组覆盖度>1时，细菌在皮肤样品中存在的可能性较大，结果显示有7个共同的阳性致病菌，如S.aureus、S.epidermidis、S.haemolyticus、S.flexneri、肺炎支原体(Mycoplasmahyorhinis)、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)和嗜热厌氧杆菌(Thermusthermophilus)。

3 讨论

2016年日本学者通过16S rRNA测序分析了SD皮损处微生物群落的变化，该研究发现葡萄球菌属、链球菌属和不动杆菌属在SD患者中升高，而丙酸杆菌属无明显变化[14]。本研究通过宏基因组测序分析发现，葡萄球菌属的细菌，如S.aureus、S.epidermidis和S.haemolyticus，在SD样品中也升高，而丙酸杆菌属的细菌如P.acnes反而减少。该结果产生的原因可能与16S rRNA在分析微生物群落的过程中不能精确到菌种的水平有关[15-16]。本研究发现，SD组皮肤细菌的相对丰度较健康组减少，以P.acnes的减少最为明显。尽管如此，SD组的皮肤微生物仍以细菌为主。分析结果还显示SD皮损处的细菌α-多样性较健康

图2 脂溢性皮炎患者皮损处存在细菌群落失调 2A: 健康组和SD组间微生物组成比较; 2B: 健康组和SD组P.acnes的相对丰度; 2C: SD组微生物的构成比; 2D: 健康组和SD组间微生物的β-多样性

Fig.2 Bacterial dysbiosis was found in SD lesion. 2A: Comparison of microbial composition between healthy group and SD group; 2B: Relative abundance ofP.acnesin healthy group and SD group; 2C: Microbial composition of SD group; 2D: Microbial β-diversity of healthy group and SD group.

图3 菌群失调情况及相关α-和β-多样性的变化 3A: ROC曲线判断样品是否存在菌群失调(ROC基于P.acnes的相对丰度计算; AUC: 曲线下面积); 3B: 菌群失调时健康组和SD组的α-多样性; 3C: 菌群失调时健康组和SD组的β-多样性；3D: 无菌群失调时健康组和SD组的α-多样性; 3E: 无菌群失调时健康组和SD组的β-多样性

图4 脂溢性皮炎患者皮损处存在共同致病菌 4A: LDA分析,LDA数值>2的细菌被列出; 4B:各疾病样品中共同的细菌

表1 ROC曲线评估SD组样品的细菌基因组覆盖度

组升高，提示细菌的种类发生改变；同时，细菌的β-多样性亦发生改变，提示细菌的含量也发生了相应改变。由于P.acnes是皮肤细菌群落中的主要细菌，疾病发生时对该菌的影响也较大[17-18]。分析显示P.acnes的相对含量<80%，提示SD皮损处出现了菌群失调。

另一方面，过去一直认为马拉色菌是SD的主要致病菌[2-3]，临床上使用抗真菌药物可改善SD的相关症状[19]；但随着宏基因组测序技术的不断发展，有学者发现M.globosa是皮肤微生态结构的正常真菌之一，且为主要的真菌[20-21]。同时，也有学者发现马拉色菌及其亚种与SD无明显相关性[22]。本研究中，健康组与SD组的真菌β-多样性并无差异，这也侧面说明了真菌的含量未发生改变。这一结果与Sandstrom等[22]的研究结果相似。因此，本研究认为部分SD患者皮损处可出现菌群失调，但马拉色菌是作为原发感染的病原体，还是作为菌群失调后继发感染的病原体参与SD的发生，或该菌是否为SD的致病菌仍有待考究。

综上所述，本研究采用宏基因组测序分析并比较了SD皮损和健康皮肤之间微生物的差异，发现SD皮损处存在菌群失调的现象，为后续进一步研究SD奠定了基础。由于患者面部的脂溢性皮炎在治疗1周后未完全康复及在康复后未复诊，本研究未能采集治疗后患者面部的皮肤微生物样品，未能全面展示面部微生物由健康到疾病、再恢复健康的整个过程，这将在后续的研究中进一步探讨。