检测活性硫物种小分子荧光探针的研究进展

刘喜灵， 张淑平*

（上海理工大学 理学院，上海 200093）

活性硫物种（RSSs）是一类具有氧化还原活性的含硫小分子，在维持生物体的稳态过程中起重要作用。生物体内活性硫的生成与清除处于平衡状态，从而保障生命活动的正常进行。当这一平衡被打破，导致活性硫物种浓度超过生理限度时就会损伤体内的物质，进而引发一系列疾病，如癌症、神经衰退性疾病、心血管疾病、糖尿病等[1]。由于其难以捉摸的性质和多种形式，了解其如何影响细胞信号传导及其作用分子机制对疾病药物的研究起关键作用。鉴于活性硫物种的高度重要性，迫切需要用于监测其在体内的浓度和分布的有效工具。

荧光成像作为一种有效的研究方法已广泛用于生物学研究中。由于具有高选择性、快速响应、低毒性和高的时空分辨率等特点，而被广泛设计成包括各活性硫物种在内的各种底物的荧光探针。因此，开发性能良好的荧光探针成为了研究的关键。

本综述总结了近两年内检测生物硫醇、H2S以及SO2衍生物的荧光探针，强调了探针在设计、传感机制、传感性能和生物应用方面的基本特征，为新型活性硫荧光探针的设计提供了指导方法。

1 同时区分生物硫醇荧光探针的研究进展

谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）等生物硫醇在维持氧化还原稳态、充当抗氧化剂和自由基清除剂方面起着重要作用[2]。例如，GSH可以充当ONOO-清除剂。GSH含量升高可以保护氧化应激的细胞，细胞对ONOO-的敏感性在很大程度上取决于存在的细胞内GSH的浓度[3]。Cys参与蛋白质合成、生物氧化还原稳态和排毒等多个生物学过程[4]，与心血管疾病、发育迟缓和肝损伤相关。而Hcy可以激活各种信号途径来诱导内在的促凋亡机制，这种机制通常与心血管疾病有关[5]。为了了解各自的作用机理，区分三种硫醇具有重要的生物学意义。

生物硫醇类探针，一般通过不同的荧光信号来区分 Cys/Hcy/GSH，其检测机制大多基于硫醇的巯基与氨基和多反应位点探针发生不同的化学反应生成不同荧光性质的产物来区分的。2018年，Huang Jing等[6]开发出一种以磺酰基苯并二唑作为识别点，设计了新型荧光探针1，用于区分Hcy和GSH。探针1容易合成且收率高，同时对Hcy和GSH的检测具有很高的选择性。探针1还显示出与Hcy的比例荧光响应，该探针已成功用于监测活细胞中的Hcy和GSH。图1是区分生物硫醇的探针1-3和机理图。

同年，Yin的小组报告了一个具有四个反应位点的多通道荧光探针2[7]。在Cys存在下，457 nm处的荧光发射增强了108倍。而在Hcy的作用下559 nm处出现了一个新的发射峰，GSH在529 nm处诱导了荧光增强。最近，此研究小组通过引入氨基供体部分和 2-氰基丙烯酸乙酯基团设计了探针 3[8]，从而提高了探针的量子产率及其在水中的溶解度。重要的是，探针3已成功应用于活细胞中具有三个通道的内源性生物硫醇成像。

图1 区分生物硫醇的探针和机理图

2 H2S 荧光探针的研究进展

H2S是一种内源性气态递质，可调节多种生理和病理过程，包括神经传递、血管舒张、炎症、动脉粥样硬化、氧化应激和胰岛素信号传导抑制等[9]。H2S的生物学重要性促进科研工作者开发出相应的荧光探针。

2.1 叠氮基还原机理

许多研究表明，叠氮基是一种H2S的出色识别受体，它易于引入并且对H2S具有高度特异性。叠氮基是一种荧光猝灭取代基团，H2S可以将叠氮化物还原为氨基，来实现荧光的开启。基于此机理，2019年，Fang课题[10]基于罗丹明的共轭体系构建了一种检测H2S的新型可捕获红色荧光的探针4。与H2S作用后，630 nm处的荧光大大增强。探针4还成功应用于HeLa细胞和斑马鱼幼虫中H2S的成像。刘彩云课题组[11]开发了一种简单的靶向高尔基体的荧光探针5，用于跟踪高尔基体中的H2S。探针5对H2S具有良好的选择性和敏感性，成功用于追踪活细胞和斑马鱼的高尔基体中H2S水平的变化。更重要的是，它可以在高尔基体特异性应激素莫能菌素引起的高尔基体应激反应下实现H2S产生的原位可视化。探针5的开发有助于揭示应激反应中H2S的细胞保护功能。而且表明了H2S将被用作高尔基体应激反应的替代生物标志物。近来，该课题组又开发了一种新型的靶向高尔基体的H2S荧光探针6，该探针的开发为研究高尔基体应激反应及相关疾病提供了一种新的化学工具。图2 是基于叠氮基还原机理的H2S荧光探针4-6的结构。

图2 基于叠氮基还原机理的H2S荧光探针的结构

2.2 H2S 的亲核反应性质

H2S在水溶液中，主要以HS-的形式存在，其具有较强的亲核反应活性，容易发生亲核取代和亲核加成。2,4-二硝基苯基醚易于被H2S分解，基于此机制的探针越来越多的被报道。Zhao课题组[12]开发了一种新型的基于水溶性花青素的H2S荧光探针7、8。探针7、8具有快的时间响应和良好的荧光增强，其中探针8在4 s内达到饱和强度的一半，并在2分钟内完成响应，同时荧光增强了115倍。因而，将探针8用于活小鼠中的H2S检测，并证明了H2S代谢的快速。Tang课题组[13]设计并合成了一种简单的H2S荧光探针9，探针9显示出对H2S的高选择性和敏感性，具有长波长发射（607 nm）、大的斯托克斯位移和良好的抗干扰能力。并在水样、葡萄酒样品和活细胞中评估了探针9检测H2S 的实际适用性。而且，通过电纺丝制备的9掺杂的聚乳酸（PLA）纳米纤维膜可以用于检测H2S气体。图3 是基于亲核反应机理的H2S荧光探针7-9的结构。

图3 基于亲核反应机理的H2S荧光探针的结构

3 SO2及其衍生物荧光探针的研究进展

在生物体中，SO2可以由含硫氨基酸L-半胱氨酸内生产生[14]，内源性SO2可以在体内维持生物硫和氧化还原的平衡，调节血液中的胰岛素水平并降低血压[15]。在水中，二氧化硫（SO2）转化为亚硫酸氢根（HSO3-）和亚硫酸根阴离子（SO32-），它们与细胞、肺癌和心血管疾病中的神经元损伤密切相关[16]。因此，亚硫酸氢根和亚硫酸根阴离子的比例感测已成为研究的重点。

3.1 迈克尔加成法

设计SO2衍生物的荧光探针最常用的机理方法是迈克尔加成法。吸电子基团可以降低碳-碳双键的电子密度，SO32-和HSO3-可以很容易地攻击碳-碳双键，中断π-共轭并改变电子构型。2018年，Hu等[17]通过迈克尔加成反应机理开发了一种用于检测HSO3-的新型荧光探针10，探针10对SO32-/HSO3-体现出高响应速度和灵敏度 ，并可用于检测HeLa细胞中的HSO3-。同年，Xu Jing等[18]开发了一种快速的细胞渗透的探针11，用于选择性灵敏性检测活细胞中的SO32-/HSO3-。更重要的是该探针具有出色的细胞渗透能力，整个细胞渗透过程只需要2 min，能更好进行活细胞成像。Guo等[19]开发了两种基于苯并噻唑的荧光探针12、13，用于检测HSO3-。探针和HSO3-作用后关闭了分子内电荷转移（ICT）效应，却开启了激发态分子内质子转移（ESIPT）机制而产生荧光。探针12、13被成功地应用于在A549细胞中可视外源HSO3-。

2019 年，Yan等[20]基于分子内电荷转移（ICT）机制，开发了一种新型的比率荧光探针 14用于检测SO32-/HSO3-。探针显示对SO32-/HSO3-快速响应（60s内）、良好的选择性和高的灵敏度（检测限28 nM）。重要的是，探针被应用于测量实际样品中的亚硫酸盐水平。最近，Zhang课题组[21]设计一种易于合成的靶向线粒体的比率荧光探针15，用选择性的检测SO32-/HSO3-。探针15具有良好的膜通透性和较低的细胞毒性，成功用于线粒体中SO32-/HSO3-的比例检测。图4 是基于与醛的亲核反应的HSO3-/SO32-荧光探针10-15的结构和机理。

图4 基于与醛的亲核反应的HSO3- /SO32-荧光探针的结构和机理

3.2 醛的亲核加成

除上述作用机理外，基于醛的亲核反应机理设计的探针也被广泛的应用。2018年，唐波课题组[22]报道了一种针对HSO3-的靶向线粒体的荧光探针16。探针16在60s内显示出明显的增强的荧光，并在HeLa细胞和斑马鱼中外源性和内源性HSO3-成像。而且，首次在视觉上发现线粒体SO2与HeLa细胞的早期凋亡密切相关。

2019 年，Manoj Kumar组[23]开发出了一种新型的以醛基为反应中心的探针17，用于检测SO2衍生物。探针17与NaHSO3作用后，生成一个强氢键供体OH基团。通过产生的分子内氢键有效抑制C＝N的异构化，进而在545 nm处有效地增强了荧光。探针在PH5.5的条件下，检测限为3.75 µM，响应时间少于15 s，并被用于细胞和斑马鱼中成像。

同年，Zhang等[24]基于此机理设计并合成了具有双重猝灭机制的荧光探针 18，该探针可以克服 Cys干扰，选择性地检测SO2。探针18与Cys的反应会阻止内部旋转，保持ICT的过程，因此产生了较弱的荧光。与SO2的反应有效地抑制了两种淬灭机理，而产生了强烈的蓝色荧光。探针18显示出高选择性、高灵敏度和对SO2的快速响应以及低细胞毒性，并成功实现了外源和内源SO2的比例成像。

图5 基于与醛的亲核反应的HSO3- /SO32-荧光探针的结构和机理

4 总结和展望

本文总结了区分Cys/Hcy/GSH的具有多个通道的荧光探针以及H2S和SO2的荧光探针的最新进展。尽管在该领域取得了重大进展，许多探针被用于生物成像，但检测活性硫物种的设计和应用中仍存在一些挑战：1）需要开发新的传感机制来寻找性能更好的探针；2）除了研究体外和体内荧光成像外，还需要对生物学应用进行全面评估，用于与某些特定疾病相关的生物样品的临床测试。