近红外光谱法快速测定化橘红中柚皮苷的含量

梁 颖 ， 高鸿彬 ， 李晓丹 ， 杨松林 ， 马 丽 ， 刘 浩 *

（1.广东食品药品职业学院 药学院，广东 广州 510520；2.第二军医大学 长海医院药学部，上海 200433；3.广州安诺科技股份有限公司，广东 广州 510863）

2016年5 月，化橘红入选广东岭南中药材第一批立法保护品种，是产于广东化州的珍稀名贵特产，为“中国四大南药”和“十大广药”之一。化橘红为芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，临床多用于治疗咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶痞闷等症[1-6]。在化州种植的橘红称为化橘红，为道地药材，比产于异地的同种药材的质量更好。正宗的化橘红制作工艺复杂、成本高，其销售价格较为昂贵。不少商家为牟取暴利而出售假冒伪劣化橘红产品，因此导致化橘红的假货和伪品成堆出现。而且其外形气味一般与真货及其相似，以至于普通消费者难以辨别化橘红的真假。

化橘红主要有效成分是黄酮类化合物，其中最主要是柚皮苷和野漆树苷，二者含量之和占化橘红黄酮类物质总量的84%以上。其中《中国药典》2015年版中的关键指标为柚皮苷含量，许多文献研究也已经证明柚皮苷是化橘红的主要有效成分之一[7-9]。化橘红在《中国药典》2015年版中要求柚皮苷含量不低于3.5%[7]，而《中国药典》2005年版仅要求柚皮苷含量不低于1.5%，两者相比足足提高了2倍多。

有关化橘红含量测定已有文献报道，化橘红中柚皮苷的含量测定方法一般用紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、高效液相色谱法（HPLC）等[9-14]。而传统的检测化橘红中柚皮苷含量的方法虽然检测精度高，但是操作过程复杂、费时费力、耗用大量试剂，并且还会对化橘红的样本造成一定的破坏性伤害，无法实现经济成本低廉的快速无损检测。因此建立快速测定柚皮苷的含量方法，是非常有必要的。针对现有技术缺点，本文采用近红外光谱法进行了系统的化橘红快速鉴别和含量测定研究。近红外光谱法具有信息量大、便捷、快速、无损等特点，可作为药品、食品等的快速检测手段，可以实现样品的快速鉴别和化学成分的快速测定[15-21]。

1 实验

1.1 材料与试剂

化橘红药材，购自多家医院药房和零售药店，产地来自于广东化州、广西等化橘红主要产区，44个批次的样品；柚皮苷对照品（纯度：98%），购于成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色谱纯，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司）；乙酸（分析纯，广州化学试剂厂）；石油醚（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；水为纯净水（怡宝牌）。

1.2 仪器设备

SupNIR-2700近红外光谱分析仪（聚光科技(杭州）股份有限公司），Agilent-1260型高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、DAD 检测器等）（Agilent公司），C18柱（150 mm×4.6 mm，4 µm）（Agilent公司），CJ-100S超声清洗仪器（深圳市超洁科技实业公司），二两装高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司），BAS224S电子天平（德国Sartorius公司），三号筛网（50目）（上虞市道墟五四仪器纱筛厂），微孔滤膜（规格为0.22 µm）（津腾牌）。

1.3 实验方法

1.3.1 采集近红外光谱数据

将化橘红样品干燥，粉碎过三号筛网（50目），密封，干燥保存，即得化橘红样品粉末。各称取44份化橘红样品粉末3 g，装入石英瓶，压实，进行测定。近红外光谱仪参数设置为：光谱采集范围为2 500～1 000 nm；分辨率为1 nm；扫描次数为64次；测样方法为积分球漫反射，用于建立模型。44个化橘红样品的近红外光谱叠加图如图1所示，每条谱线由1557个数据点构成。

图1 近红外光谱叠加图

1.3.2 化橘红中柚皮苷的含量测定

1.3.2.1化橘红中柚皮苷的提取

各取化橘红样品44批，置于玻璃干燥器中干燥过夜，取出，粉碎过50目筛，精密称定1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL石油醚，超声处理30 min，取出放冷后，过滤，弃去滤液，将滤纸剪碎塞回锥形瓶中，放置通风橱等石油醚挥干。准确加入50 mL甲醇至锥形瓶中，精密称定，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22 µm滤膜，即得。

1.3.2.2供试品溶液的制备

准确量取上述“1.3.2.1”提取溶液4.0 mL至干净干燥的10 mL量瓶中，加纯化水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.3.2.3对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品0.031 45 g，置10 mL具塞量瓶中，加甲醇溶解，定容，于冰箱2～8℃保存。同时配制甲醇-水（1∶1）用以稀释对照品溶液，备用。

1.3.2.4色谱条件

色谱柱：Agilent C18色谱柱（150 mm×4.6mm，4 μm）；流动相：0.5%乙酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～5 min，30% B；5～28 min，35% B；28～40 min，95% B）；流速为1.0 mL/min；检测波长为283 nm；柱温为室温；进样量20 μL。按照上述色谱条件进行测定，得到对照品和样品色谱图，如图2a、2b所示。

图2 对照品（a）和样品（b柚皮苷）HPLC图

2 结果与讨论

2.1 样品含量测定

按“1.3.2.4”项下色谱条件测定44批化橘红中柚皮苷的含量，含量测定结果如表1所示。

表1 化橘红中柚皮苷的含量

（续表1）

从表1可以看出，不同批次的化橘红样品中柚皮苷的含量差异非常大，最高为9号样品，含量为25.89%，最低为33号样品，含量为1.55%，尽管在售卖的时候都标以化橘红，实际上质量差异非常大，部分是以一般橘红冒充化橘红的，达不到应有的治疗效果。在44批样本中，21、32、33的柚皮苷含量未达到中国药典的规定（3.5%），大多数样本是符合药典质量要求的，事实上，在符合药典的产品中，柚皮苷的含量差异也是比较大的，其中价格比较高的乳果含量最高。

对于一般人员来说，判断不同化橘红的质量是比较困难的，而高效液相色谱等含量测定方法专业性强、耗时长、成本高，也给化橘红的质量判断带来了障碍。

2.2 模型的建立与验证

2.2.1 化橘红中柚皮苷定量分析模型的建立方法

采用偏最小二乘法（PLS）建立校正化橘红中柚皮苷含量的模型。近红外光谱进行预处理的方法有：一阶导数、二阶导数、矢量归一化、最小-最大归一化、多元散射校正等。在每个化橘红中柚皮苷含量指标模型的建立中，光谱预处理方法的选择原则一般是使得偏最小二乘法能够在光谱数据和柚皮苷含量指标数据间建立最佳的相关关系。分析模型检验方法采用交叉留一验证来建立。以上计算使用 BRUKER公司OPUS 7.8执行。

2.2.2 主因子数的选择

主因子数的选择影响建模结果的好坏。本研究中，柚皮苷主因子数的筛选和校正均方差之间的关系图如图3所示，柚皮苷以主因子数 8建模，RMSECV值最小。

图3 主因子数对甘草酸定量分析模型校正均方差的影响

2.2.3 不同预处理方法优化的校正模型选择结果

建立化橘红中柚皮苷模型后，采用的评价指标有建模集和验证集变量间的线性关系（R）、建模集交叉验证均方差（RMSECV）。对于同一化橘红样品集所构建的近红外定量分析校正模型，相关系数R2越接近1、均方差 RMSECV越小，表示模型拟合能力越佳，所建柚皮苷的模型适用性越强、回归（预测）结果越好[20]。经过筛选不同预处理方法优化的校正模型比较结果，最终确定一阶导数+多元散射校正为光谱预处理方法，检验方法采用交叉验证以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波长作为最佳范围，如表2所示。

表2 不同预处理方法对模型的影响

表3 不同波长范围对模型的影响

从表2和3可以看出不同预处理方法或者不同波长范围对模型的影响是不同的。其中一阶导数+多元散射校正的数据预处理方法得到了最优的结果，一阶导数可以消除样本各成分之间光谱之间的相互干扰导致的光谱重叠，提高分辨率，多元散射校正主要用来消除样本颗粒分布的不均匀，以及颗粒大小差异而导致的光散射影响，说明化橘红在粉碎时不同的颗粒大小对结果影响较大。

2.2.4 化橘红中柚皮苷定量分析模型的建立

以44批化橘红样品中35份组成模型的校正集，8份作为验证集，用一阶导数＋矢量归一化作为近红外光谱预处理方法，以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波长为最佳波段范围，平滑点数为17，柚皮苷校正模型的交叉检验相关系数R2＝0.978，校正均方差 RMSECV＝0.997，各项参数的评价良好。近红外光谱预测值与真值的相关图如图4所示。

图4 化橘红NIR预测值与真值的相关性

3 总结

本实验采用高效液相色谱法（HPLC）测定含量结合近红外光谱检测技术，利用偏最小二乘回归分析结合交叉验证法，建立快速测定化橘红中柚皮苷含量的模型。建立的校正模型的相关系数和内部交叉验证均方差分别为：R2＝0.978，RMSECV＝0.997，表明预测结果良好。该法的建立证明了近红外光谱技术应用于化橘红药材中柚皮苷含量测定的可行性。

本实验是定量分析模型，其准确性是在大量具有代表性样品的精准测定及模型后期持续不断的完善之上而建立的。在建立检测化橘红柚皮苷含量的过程中，样品代表性越强，模型的实用性就越强，但是这需花费大量的时间和精力。从检测化橘红中柚皮苷含量的建立模型过程来看建立的过程是非常关键的，它将会直接影响近红外光谱分析柚皮苷含量的工作效率和质量。只有选择合适的预处理方法和合适的波长范围来减少光谱的干扰信息，才能获得较理想的结果。柚皮苷的近红外模型建成后，只需扫描获得化橘红样品的近红外光谱图，根据模型即可直接预测出化橘红中柚皮苷的含量，可以使繁琐的常规分析方法变得简便易行且快速无损。本文所建立的模型对于测定化橘红中柚皮苷是非常有效的，值得借鉴和推广使用。